主题
阶段七：靶点验证框架（组织落位 · 独立复制 · 可成药性）
阶段六筛出候选靶点后，用三层外部证据把它们钉死：组织/细胞落位（eQTL + 单细胞）、独立队列复制、可成药性。 本页是执行框架 + 数据可及性现状 + 排期，随查随更。
我们和已发表框架的差异（写作卖点）
| Orozco 2020 (Cell Rep) · Hamel 2024 (Nat Commun) | 我们 | |
|---|---|---|
| 分子层 | eQTL（表达） | pQTL（蛋白，更接近药物靶点） |
| 因果方法 | 共定位 | MR + HyPrColoc（已完成） |
| 结局 | AMD / 青光眼单一 | 糖尿病并发症 + AMD 双线 + FinnGen R9/R13 |
Orozco 做 eQTL→病，我们做 pQTL→病。再补一层视网膜 eQTL，就能做三性状共定位（pQTL + eQTL + AMD），这是两篇模板都没有的。
一、三层证据链
阶段六候选靶点（SPRY2 / TNFRSF10A / CSF2 / TGFB1 / WARS1 …）
│
├── 第1层 组织落位：变异→视网膜表达→血浆蛋白→病 是否同一因果变异？
│ · 三性状 HyPrColoc: 血浆 pQTL + 视网膜 eQTL + AMD
│ · 单细胞: 落在 RPE / Müller / 小胶质 / 脉络膜内皮 哪类细胞
│
├── 第2层 独立复制：换一个 AMD 队列，靶点还在不在？
│ · IAMDGC (Fritsche 2016) 独立于 FinnGen
│
└── 第3层 可成药性：有没有现成药 + 方向对不对？ ✅ 已完成
· Open Targets + ChEMBL二、可成药性结果（✅ 已完成）
results/druggability.csv（Open Targets Platform，13 靶点）。关键：药物动作类型必须和 MR 方向一致——MR 说"抑制"就要 INHIBITOR/ANTAGONIST，说"增强"就要 AGONIST。
🟢 方向一致 + 有临床期药物（最强，可直接写"可重定位"）
| 靶点 | MR 方向 | 已知药 | 最高期 | 说明 |
|---|---|---|---|---|
| CSF2 | 抑制（湿性AMD OR=1.50） | 6 个抗 GM-CSF | Phase 3 | LENZILUMAB/GIMSILUMAB/NAMILUMAB 全是 INHIBITOR，方向完全对上。类风湿/COVID 在用 → AMD 重定位候选 |
| TNFRSF10A | 增强（AMD OR=0.86） | 2 个激动剂 | Phase 2 | DULANERMIN/MAPATUMUMAB 是 AGONIST，方向对上；且是已知 AMD GWAS 位点 |
🟡 有可及性、暂无对口药（新靶点空间）
抗体可及但还没有方向一致的药：SPRY2、IL7R、PILRB、GALNT3、CLPS；小分子可及：WARS1、NUDT5；PILRA 小分子与抗体双可及（同样暂无对口药）。→ 这些是"首创靶点"角度，需从头开发。
B 级的 APOE 亦为小分子+抗体双可及、无已知药；因高多效（PheWAS 617 个 Bonferroni 显著表型）不作为靶点推进，仅列备查。
🔴 方向相反（警示，别写成利好）
| 靶点 | MR 要的方向 | 现有药方向 | 问题 |
|---|---|---|---|
| TGFB1 | 增强 | 现有 5 个多是 抑制剂（抗纤维化/肿瘤） | 现成药走反方向，不能重定位；且 TGF-β 激动有安全性顾虑 |
| CASP10 | 增强 | EMRICASAN 是抑制剂 | 同上 |
一句话结论
CSF2 是目前最值得追的——MR/共定位支持 + 方向对 + Phase 3 抑制剂现成。TNFRSF10A 次之（已知 AMD 位点 + 方向对）。TGFB1 虽然共定位也支持，但现成药方向反了，重定位这条路走不通。
复现与自查（2026-07-20 修复记录）
bash
cd ~/mr-pipeline && python3 analysis/07_druggability.py # 直连即可，无需代理全表 NOT_FOUND ＝ 环境故障，不是"无可成药性"
07_druggability.py 早期把代理写死成 socks5h://127.0.0.1:10808。流水线迁到 WSL 后，该端口在宿主机(Windows)上、WSL2 走 NAT，在 WSL 内不可达 → 13 个靶点全部查询失败、全表 NOT_FOUND，而脚本静默吞掉 curl 错误、退出码仍为 0，run_pipeline.sh 照样打了 07.done，把一份好结果覆盖成空表且无人察觉。
已修（2026-07-20）：
- 默认直连——Open Targets 公共 API 不需要代理；确需时用环境变量
OT_PROXY=... python3 analysis/07_druggability.py覆盖； - 失败不再静默——打印 curl 退出码与 stderr；全部查询失败时不写文件并
exit 1（保住上一次的好结果，也让编排不误标.done）； - 符号别名回退——Open Targets 用 HGNC 现行符号，
WARS需按 WARS1 查（精确匹配 → 别名表 → "原符号+一位数字"三级回退），实际命中符号记入新列symbol_queried； - 新增
release列——标注每个靶点由R13/R9/R13+R9哪个整合网络提出。
自查一句话：打开 results/druggability.csv，若 ensembl 列出现整片 NOT_FOUND，先怀疑网络，别当结论。
release 列怎么用
可成药性是靶点自身的属性，与 FinnGen 是 R9 还是 R13 无关，所以两个 release 的候选合在一次查询里没有问题。只报告 R13 时按 release 列筛 R13 或 R13+R9 即可：本表 13 个靶点中 R13 独有 8 个（PILRA/PILRB/TGFB1/WARS/CSF2/CASP10/TNFRSF10A/SPRY2）、R13+R9 共有 1 个（APOE）、R9 独有 4 个（IL7R/NUDT5/CLPS/GALNT3）。
三、组织落位（第1层）· 三性状共定位（NSR 版已完成）+ 数据现状
视网膜 eQTL —— 无干净公开源，多半要 EGA 申请/邮件（2026-07-18 实测更新）
| 数据源 | 组织 | 可及性（2026-07-18 实测/原文核实） | 途径 |
|---|---|---|---|
| Strunz et al.（Regensburg / Weber 组，视网膜 eQTL mega-analysis，PLOS Genet 2020） | 视网膜(NSR)，无 RPE | 🟢 公开、实测可用（www-huge.uni-regensburg.de → Databases 页直链下载，chr1 文件 200/205MB，无需登录/EGA） | ✅ 首选，现在就能做：Retina_..._FastQTL_nominal_chr*.txt.gz = 全区域所有 SNP，含 slope(β)/slope_se(SE)/pval_nominal/位置/等位，hg38（与 pQTL/FinnGen 同 build，免 liftover） |
| Orozco（eye-eqtl.com） | 视网膜 + RPE | 🟡 浏览器逐基因查，非批量下载 | 有 RPE 但只能在线查 |
| Nat Commun 2026（Manchester Eye Tissue Repository，201 眼，NSR + RPE 分开，148 万 cis-eQTL） | NSR + RPE | 🔴 确认 EGA 受控（原文：eQTL results under controlled access，EGAS50000001443 / EGAD50000002082，DAC 4 周审批） | 最优但要 EGA 申请 |
| EyeGEx（Ratnapriya 2019 Nat Genet） | 视网膜 | 🔴 旧公开链接已失效（实测 GTEx tar 404、桶已不存在）；原文亦称"controlled，靠联系通讯作者" | 只能邮件问作者 |
RPE 才是 AMD 最相关组织，但公开的 Strunz 大概率只有 NSR。权衡：要快/公开→先试 Strunz(NSR)；要 RPE→走 METR EGA 申请(4 周)或 Orozco 浏览器。
文章标题（去看原文找 Data Availability）：Paired DNA and RNA sequencing uncovers common and rare variation regulating human retinal gene expression（Nat Commun 2026,
s41467-026-72979-4；开放预印本 medRxiv10.1101/2025.04.25.25326445，PMC12045431）。
要做三性状共定位，需要 cis 窗口整段 eQTL 的 nominal 汇总统计（每个候选基因 ±500kb–1Mb 内所有 SNP 的 β/SE），不是只有显著 eQTL 或 top hit。 很多库只放显著 eQTL，那不够。Strunz nominal 文件满足此要求。
✅ 三性状共定位结果（NSR 版，2026-07-18 实测）
脚本 analysis/10_eqtl_coloc.R：对 R13 A 级 AMD 候选，跑 血浆 pQTL(UKB-PPP) + 视网膜 eQTL(Strunz NSR) + AMD(FinnGen R13) 三性状 HyPrColoc（全 hg38，chr:pos 对齐）。数据：Strunz nominal 22 条染色体已下到 D:\mrdata\eqtl_retina_strunz（2.2G，公开）。
| 靶点 | pQTL+AMD 共定位 | 视网膜 eQTL 是否入簇 | 结论 |
|---|---|---|---|
| TGFB1 | PP=0.99 | ❌ 不入簇 | 血浆层强共定位；非经 NSR 表达 |
| WARS（cis 基因 WARS1） | PP=0.96 | ❌ | 同上（2026-07-20 修复符号回退后新增，共同 SNP 2617） |
| CASP10 | PP=0.86 | ❌ | 同上 |
| PILRA / PILRB | PP=0.85 | ❌ | 同上 |
| SPRY2 | 未检出高 PP 簇 | ❌ | 共同 SNP 2797，未过阈 |
| CSF2 / TNFRSF10A | — | Strunz 里非 eGene | 视网膜无 eQTL（已逐一实测 CSF2/GMCSF、TNFRSF10A/TRAILR1/DR4 均 0 行；CSF2 = 循环免疫因子，合理） |
两层结论：① 5 个候选的血浆 pQTL 与 AMD 强共定位（PP 0.85–0.99），独立于血浆层再证 MR 信号是同一因果变异（加分）；② 视网膜 eQTL 均不加入 → 这些蛋白影响 AMD 不经神经感觉视网膜（NSR）表达。
订正（2026-07-20）：WARS 曾被误判为"无数据"
本表旧版写「WARS1 — 无 UKB-PPP pQTL tar」，这是错的：tar 一直都在（wars_p23381_oid21084_v1_neurology.tar，chr14 文件完好）。真实原因是基因符号版本差——本流水线的 cis gene 用 HGNC 现行符号 WARS1，而 Strunz(2020) 的 gene_symbol 列用当年的旧符号 WARS（chr14 实测 6145 行、窗口内 2917 行）。read_eqtl() 只做精确匹配、查到 0 行就 return(NULL)，再被一句笼统的"三者区域不全"盖过去，看不出缺的是哪一源。
已修：符号三级回退（现行符号 → 别名表 → 去掉末位数字）并打印实际命中的符号；"区域缺失"日志与 verdict 改为点名缺哪一源。重跑后 WARS 得 PP=0.96，是仅次于 TGFB1 的第二强，此前一直被丢弃。
⚠️ 关键限定：Strunz 只有 NSR，无 RPE
RPE 才是 AMD 最相关组织。所以"eQTL 不共定位"的准确表述是"非经 NSR 表达；RPE 未测，不能排除经 RPE 表达的机制"。要坐实"组织落位"这一层，仍需 RPE eQTL（METR 的 EGA 申请）。当前 NSR 版给出的正是"血浆层共定位强、但非经 NSR"这一真实可写结论，并为申请 RPE 数据提供了实证理由。
✅ 单细胞细胞定位结果（2026-07-18 实测完成）
脚本 analysis/11_singlecell.py（scanpy，backed 省内存模式——WSL 仅 15G，满载 OOM）。数据 HRCA（CELLxGENE 公开）all-cells 子集：26.6 万细胞 / 18 类细胞（含 RPE/Müller/小胶质），2.4G 已下到 D:\mrdata\singlecell。12 个候选全部命中。算每基因在各细胞类型的均表达 + %表达。
| 组 | 靶点 | 主要表达细胞（均表达, %表达） |
|---|---|---|
| A. 视网膜里有表达（可能局部机制） | SPRY2 | Müller 0.37(28%)、星形胶质 0.34、RPE 0.33(22%) |
| TGFB1 | 小胶质 0.22、Müller 0.17 | |
| PILRA | 小胶质 0.21（免疫细胞，与其功能吻合） | |
| GALNT3 / WARS / NUDT5 | Müller / 神经节（后二者偏广谱管家） | |
| B. 视网膜几乎不表达（→ 系统通路） | TNFRSF10A | RPE 仅 0.003(0.2%) |
| CSF2 | 全 0%（GM-CSF 循环免疫因子，合理） | |
| CASP10 / IL7R / CLPS | ~0% |
产出 results/singlecell/celltype_expression.csv（基因×细胞类型）+ dotplot.png。
⑪⑫ 相互印证（可写进论文）
TNFRSF10A、CSF2：⑪（Strunz 里非 eGene）+ ⑫（细胞不表达）双重确认"非视网膜局部"→ 系统/循环通路，证据一致。 SPRY2、TGFB1、PILRA：⑫ 显示确实在视网膜胶质/小胶质表达，但 ⑪ 说其 eQTL 不与 AMD 共定位 →「有表达，但该表达的遗传调控不是 AMD 的因果变异」。
单细胞是"解释器"不是"筛选器"
你测的是血浆蛋白。CSF2（GM-CSF）循环起作用——"视网膜里不表达"不代表 MR 假，而是提示走系统通路。别用单细胞否定靶点，用它写机制。
数据来源：首选 HRCA（CELLxGENE / GEO GSE265774 / HCA Portal，Nat Genet 2026）；备选 Monavarfeshani Broad SCP SCP2310。全公开、无需申请。
单细胞是"解释器"不是"筛选器"
你测的是血浆蛋白。CSF2（GM-CSF）是免疫细胞来源、循环起作用的——"视网膜里不表达"不代表 MR 假，而是提示它走系统/循环通路。别用单细胞否定靶点，用它写机制。
四、独立复制（第2层）· ✅ 已完成，结果利好
用 IAMDGC（Fritsche 2016 晚期 AMD，欧洲，16,144 病例 / 17,832 对照） 复制——与 FinnGen 完全独立的队列。数据 rsid 可用率 95.9%，走 rsid 匹配（build 无关）；接入只加一行 outcome_manifest.csv。
复制结果：方向 100% 一致
| 靶点 | FinnGen R13 AMD | IAMDGC 独立复制 | 判定 |
|---|---|---|---|
| TNFRSF10A | OR=0.86 | OR=0.79, p=1.6×10⁻⁹ | ✅ 强复制（正式显著 + 同向；已知 AMD 位点） |
| CASP10 | OR=0.73 | OR=0.71, p=5.9×10⁻⁴ | ✅ 复制（正式显著 + 同向） |
| APOE | OR=1.22 | OR=1.46, p=7.6×10⁻⁴¹ | ✅ 复制（但高多效，B 级） |
| SPRY2 | OR=0.53 | OR=0.57, p=0.015 | ○ 同向，效应量近乎一致，名义显著 |
| CSF2 | OR=1.257 | OR=1.254, p=0.013 | ○ OR 几乎完全相同，名义显著 |
| TGFB1 | OR=0.75 | OR=0.74, p=1.3×10⁻³ | ○ 同向一致，名义显著 |
| PILRA/B | OR=1.06 | OR=1.04, p=0.039 | ○ 同向，名义 |
| WARS | β=0.30, p=1.2×10⁻⁶ | β=0.044, p=0.59 | ○ 同向但效应量小得多、不显著 |
怎么读
- 8 个候选全部方向一致（100% 方向复制），没有一个翻车——这本身就是强证据。
- 效应量的跨队列一致性更惊人：CSF2 是 1.257 vs 1.254、SPRY2 是 0.53 vs 0.57、TGFB1 是 0.75 vs 0.74。一个完全独立的队列给出几乎相同的 OR，比 p 值更能说明问题。
- 但 WARS 是例外，别把它算进"效应量一致"里：同向，可效应量从 β=0.30 掉到 0.044（p=0.59），跨队列一致性明显弱于其余候选。写作时它只能算"方向一致"，不能跟 CSF2/TGFB1 那种放在一起说。
订正（2026-07-20）：WARS 那一行旧版写"该 SNP 不在 IAMDGC，无法评估"，是错的
哨兵变异 rs2273804 在 IAMDGC 里有数据（screen_R13/AMD_iamdgc_all.csv 实测：β=+0.044，p=0.588），并非缺失。正确表述是"同向但未复制出显著效应"，而不是"无法评估"。
为什么有些只到"名义显著"（p<0.05 未过 FDR）？是功效，不是失败
IAMDGC 总样本 3.4 万（16k 病例 / 17k 对照），而 FinnGen R13 AMD 有 47 万（对照 45 万）——IAMDGC 对照少得多、功效低。所以"同向 + 效应量一致但没到 FDR"是意料之中，不是复制失败。正式复制看方向一致 + 效应量一致，这两条全部满足。
结论
TNFRSF10A 最硬（独立队列 p=1.6×10⁻⁹ 复制 + 已知 AMD 位点 + 可成药方向对）。CSF2 次之（OR 跨队列几乎相同 + 有 Phase 3 抑制剂）。AMD 主线站住了。
共定位复制（HyPrColoc，2 性状：蛋白 pQTL + IAMDGC AMD）· ✅ 已完成
MR 复制的是"关联"，共定位复制的是"同一因果变异"——更硬。脚本 analysis/08_replicate_iamdgc.R（IAMDGC 经 Ensembl 核实为 hg38，与 UKB-PPP 同 build，chr:pos 直接匹配，无需 liftover）。
| 候选 | 共定位（PP，候选变异） | 判定 |
|---|---|---|
| TNFRSF10A | PP=0.9997（8:23225458） | ✅ 共定位也复制 |
| SPRY2 / CSF2 / TGFB1 / CASP10 / PILRA / PILRB / WARS | None（未成簇） | ○ 独立队列未达共定位 |
订正（2026-07-20）：本轮之前只跑了 7 个候选，WARS 被漏掉
08_replicate_iamdgc.R 里候选清单曾写死为 c(...,"WARS1",...)，但 protein_info.csv 的 Assay Target 命名空间用的是 WARS（WARS1 是 cis gene 列），导致坐标与 tar 双双查不到，WARS 被 跳过(暴露区域不足) 排除在独立复制之外——与 10 号脚本是同一个符号版本差。
已修：候选改为动态读 network_R13/target_list.csv 的 A 级（与 07/10 同源，不再写死），跳过原因细化为"无 cis 坐标 / 索引无此 gene / tar 未下载"三种。重跑后 8 个候选全部参与，WARS 共同 SNP 4835、未成簇。结论不变：TNFRSF10A 仍是唯一共定位复制的靶点，但现在是基于 8/8 而非 7/8。
只有 TNFRSF10A 共定位复制——但其余"未复制"是功效不是假
IAMDGC 只有 3.4 万样本，AMD 区域信号远弱于 FinnGen R13（47 万）。共定位比 MR 更吃信号强度（要整段区域关联模式对上，不只哨兵 SNP）。所以其余候选"共定位未达"与它们在 IAMDGC 的 MR 只到名义显著一致——信号在、队列太小撑不起共定位。
★ 最硬的靶点：TNFRSF10A
跨两个独立队列、两种分析全部过关的唯一靶点：已知 AMD 位点 + 双队列 MR 复制（FinnGen p 极小 / IAMDGC p=1.6×10⁻⁹）+ 双队列共定位复制（FinnGen / IAMDGC PP=0.9997）+ 可成药（AGONIST 方向对，Phase 2）。证据链完整，建议作为主打靶点。
数据文件：
D:\mrdata\outcome\（IAMDGC_..._annotated.txt全量 6.47GB +finngen_R13_AMD_iamdgc.tsv.gz预过滤）。结果results/hyprcoloc_iamdgc/。
五、排期：三轨道并行
原则：先验证、再机制；慢变量现在就启动
细胞定位/GEO 是描述性的（在哪个细胞、变没变），不是验证性的。真正验证 AMD 主线的是独立复制 + eQTL 共定位。别让"便宜好做"挤掉"决定性但更难"。
| 轨道 | 内容 | 状态 |
|---|---|---|
| A 先验证 | ③ 可成药性 | ✅ 完成 |
| ② IAMDGC 独立复制（MR） | ✅ 完成（方向 100% 一致，TNFRSF10A 强复制） | |
| ② IAMDGC HyPrColoc（共定位复制） | ✅ 完成（TNFRSF10A PP=0.9997 复制） | |
| ① eQTL 三性状共定位（NSR 版，Strunz 公开） | ✅ 完成（analysis/10_eqtl_coloc.R；4 候选 pQTL+AMD 强共定位，NSR eQTL 不入簇） | |
| ① 单细胞细胞定位（HRCA 公开） | ✅ 完成（analysis/11_singlecell.py；SPRY2/TGFB1/PILRA 视网膜有表达，TNFRSF10A/CSF2 ~0） | |
| B 启动慢变量 | ① 视网膜 RPE eQTL（METR，EGA 受控） | ⏳ 用户已注册 EGA 账户，DAR 待审批（数据集 EGAD50000002082，DAC EGAC50000000807，约 4 周）。通过后接入 10_eqtl_coloc.R 跑 RPE 版。也可并行邮件问 METR 通讯作者要 RPE 汇总统计（更快） |
| 斑马鱼 CRISPR 设计 + 订鱼 | ⏳ 长前置期 |
课题重心已定：转向 AMD 线（2026-07-16）。R9 糖尿病并发症线基本被共定位清空（overlap 前五全是 MHC 区 LD 假象），真信号在 R13 的 AMD 线，且已通过独立复制。糖尿病并发症分析保留作方法学对照（"连头号发现 AGER 都被共定位否掉"体现严谨性）。
六、待决策 / 下一步（2026-07-19 更新）
真正剩下的只有两件（阶段七三层验证的 NSR+细胞版、独立复制、可成药性均已落地）：
- RPE 组织 eQTL（进行中）：用户已注册 EGA 账户，DAR 待审批（METR
EGAD50000002082/ DACEGAC50000000807，约 4 周）。通过后接入analysis/10_eqtl_coloc.R跑 RPE 版三性状共定位——这是唯一能补上"AMD 最相关组织(RPE)里定位"的缺口。也可并行邮件问 METR 通讯作者要 RPE 汇总统计（更快）。⚠️ 注意：METR 数据里的 eOutlier（OUTRIDER/Watershed 罕见变异）表不是 eQTL，要的是eQTL results（含 slope/se/pval，组织=RPE）。 - 与竞品差异化（写作，非分析）：见下方竞品说明。
竞品与差异化（投稿 novelty 必读）
直接竞品：Hou et al. 2025（J Ophthalmology，PMC12503973） —— UKB-PPP pQTL → 干性 AMD + 共定位 + 单细胞 + 可成药，与本课题 AMD 线高度重叠。"UKB-PPP pQTL → 干性 AMD"这个角度已被发表。
本课题差异化点（写作时突出）：① 糖尿病并发症 R9/R13 双线 + AMD，不止 AMD；② 湿性/干性 AMD 亚型分别分析；③ IAMDGC 独立队列复制（疾病侧）；④ NSR eQTL 三性状共定位。
评估过但决定「不做」的方法（避免堆冗余分析）
- SMR：其 HEIDI 检验与已有共定位重复（SMR+HEIDI ≈ 弱版 coloc），不带来新证据 → 不做。
- deCODE pQTL 复制暴露侧：非必须——已有共定位（pQTL–AMD 同因果变异 PP 0.85–0.99）+ IAMDGC 疾病复制；且 UKB-PPP(Olink) ↔ deCODE(SomaScan) 跨平台有表位差异，非干净加分 → 除非审稿人要求，否则不做。
- 结论：现有证据链（MR + 共定位 + PheWAS + LDSC + IAMDGC + NSR eQTL + 单细胞 + 可成药）已相当完整，别为"匹配模板"堆冗余分析；真正增值的是 RPE eQTL（申请中）+ 写作差异化。
相关：阶段六·靶点网络 · 下游分析 · 差异对照 · 可补充的 MR 方法