主题
反向 MR：疾病 → 蛋白
正向是 cis-pQTL（蛋白）→ 疾病；本分析把方向调过来，检验是否存在反向因果。
为什么现在才做：
R/12_bidirectional.R只被单对流水线run_all.R调用， 而本课题走批量筛查analysis/01_screen.R，且config.yaml里bidirectional.enabled = false——2026-07-31 核查时才发现这个缺口。 新脚本analysis/35_reverse_mr.R为批量筛查补上这一步。
一、方法
| 项 | 设定 |
|---|---|
| 反向暴露 | 疾病（R9_dm 的 7 个结局） |
| 反向工具 | 疾病 GWAS 全基因组显著位点 p<5e-8，不设 cis 窗 |
| LD clumping | plink1.9 + 1000G EUR，r²<0.001，10 Mb |
| 反向结局 | 蛋白水平（UKB-PPP 全基因组 sumstats） |
| 估计方法 | IVW（固定效应）；单工具时退化为 Wald ratio |
| 多重校正 | 全部 142 对一起做 BH-FDR |
坐标系铁律
LD 面板（1000G EUR）是 hg19，本课题数据是 hg38：
- clumping 只能按 rsID（r² 是单倍型属性，与坐标系无关）
- 取蛋白数据只能按 hg38 的 chr:pos（UKB-PPP tar 无 rsid 列）
实测确认 FinnGen R9 与 UKB-PPP 同为 hg38（rs7903146 两侧都是 chr10:112,998,590）。
★★ 必须剔除落在蛋白自身 cis 区的反向工具
不做这一步，整个分析都是假的
试跑时 AGER × 糖网反向 p = 3.18e-26，看着像铁证。查下去发现反向工具 rs915894 距 AGER 的 cis 锚点只有 35 kb，它对 AGER 的效应 z = −17.3—— 那是 cis-pQTL 效应本身，与"疾病导致蛋白变化"毫无关系。
| 处理方式 | 剩余工具数 | p |
|---|---|---|
| 不剔除任何 cis 工具 | 26 | 3.18e-26（假阳性） |
| 只剔 ±1 Mb（早期诊断用，非最终实现） | 23 | 0.0715 |
| 最终规则：±1 Mb + 整个 MHC（AGER 位于 MHC） | 19 | 0.0325 |
不修的话，每一个 cis 区恰好落在疾病位点上的蛋白都会假装"反向因果"， 而这恰恰是我们最关心的那批蛋白。
三个数字别混用
0.0715 只属于中间诊断步骤（当时尚未加入 MHC 整体排除）。 最终实现的操作值是 0.0325，脚本内置的回归断言校验的也是它。
:::
排除规则：cis 锚点 ±1 Mb；蛋白 cis 位于 MHC（chr6:25–34 Mb）时额外排除整个 MHC（长程 LD）。
实际剔除 379 个工具，其中 340 个来自 MHC 蛋白（涉及 49 对）。
脚本内置回归断言钉住这个病例：AGER × Retinopathy 剔除后 p 若不 >1e-3 即报错拒绝输出。 当前通过（剔 7 个工具，剩 19 个，p = 0.0325）。
二、反向工具储量
| 结局 | p<5e-8 位点 | 去模糊回文 | 在 LD 面板 | clump 后工具数 |
|---|---|---|---|---|
| T2D_mahajan | 6,598 | −1,014 | 5,584 | 98 |
| T1D_gcst | 44,613 | −6,598 | 33,577 | 94 |
| Retinopathy | 20,655 | −2,888 | 15,091 | 27 |
| Maculopathy | 16,864 | −2,375 | 12,324 | 11 |
| Nephropathy | 12,320 | −1,722 | 9,038 | 10 |
| Neuropathy | 9,464 | −1,337 | 6,975 | 7 |
| NeovascGlaucoma | 577 | −99 | 377 | 3 |
三、★ 最重要的一条：反向显著率主要由检验功效决定
142 对全部可算，47 对反向 FDR<0.05（33.1%）。但按结局拆开看：
| 结局 | 工具数中位 | 对数 | 反向显著率 | 中位 se |
|---|---|---|---|---|
| Neuropathy | 2 | 5 | 20% | 0.0337 |
| Nephropathy | 5 | 9 | 11% | 0.0210 |
| Maculopathy | 10 | 19 | 0% | 0.0075 |
| Retinopathy | 26 | 24 | 25% | 0.0099 |
| T1D_gcst | 91 | 57 | 49% | 0.0038 |
| T2D_mahajan | 97 | 28 | 39% | 0.0106 |
工具数与反向显著率的 Spearman 相关 = 0.71。
阴性结果的正确读法
基础病有 90+ 个工具，能测出 |beta|≈0.008 的效应；并发症只有 2–27 个，测不出。
所以**"某并发症上反向不显著"不等于方向已确立**，同时也可能只是功效不足。 这两种解释无法用现有数据区分，必须标注为「未发现反向证据」而非「已排除反向因果」。
四、A 级三个候选：方向未被推翻，但只能说"未见反向证据"
| 蛋白 | 结局 | 工具 | beta_rev | se | p |
|---|---|---|---|---|---|
| IFNAR1 | Maculopathy | 11 | −0.0057 | 0.0070 | 0.42 |
| APOL1 | Maculopathy | 11 | 0.0035 | 0.0067 | 0.60 |
| ERMAP | Maculopathy | 11 | 0.0014 | 0.0068 | 0.83 |
三个都不显著，正向方向没有被推翻。但按 se≈0.0068 计，这 11 个工具在 80% 把握下 只能测出 |beta| > 0.019 的反向效应——比这更小的真实反向效应测不出来。
诚实表述：未发现反向因果的证据。不能写成已排除反向因果。
五、31 个靶点蛋白里，8 对在并发症方向反向显著
| 蛋白 | 分层 | 结局 | 工具 | beta_rev | FDR |
|---|---|---|---|---|---|
| BTN3A2 | C-MHC 区 | Retinopathy | 19 | 0.0774 | 9.2e-06 |
| ITGB7 | D-仅 MR | Retinopathy | 26 | 0.0419 | 1.2e-04 |
| TIGIT | D-仅 MR | Retinopathy | 26 | 0.0328 | 6.9e-03 |
| APOE | B-共定位支持但需注意 | Retinopathy | 25 | −0.0262 | 8.1e-03 |
| SIGLEC5 | D-仅 MR | Retinopathy | 26 | 0.0188 | 4.7e-02 |
| BCL2L15 | D-仅 MR | Retinopathy | 25 | 0.0253 | 4.0e-02 |
| HCG22 | C-MHC 区 | Nephropathy | 5 | −0.0572 | 3.6e-02 |
| HCG22 | C-MHC 区 | Neuropathy | 2 | −0.0884 | 4.2e-02 |
要点：
- A 级三个候选不在其中，眼科主结论不受影响
- APOE 需重点披露：它在 Retinopathy 和 T2D 两个方向都反向显著，方向存疑
- HCG22 那两条基于 2 个和 5 个工具，本身极不可靠，应标为证据不足而非阳性
- BTN3A2 属 C 级 MHC，本来就带 LD 混杂标注
另有 11 对在基础病方向反向显著（APOE、NOTCH2、AGER、AIF1、LTB、MICB_MICA、 TRIM40、BCL2L15、ITGB7、PAM、SIGLEC5）。
六、正面结果：两种方法独立指向同一批蛋白
T2D 用的是 Mahajan noUKBB 版本，与暴露 UKB-PPP 无样本重叠，不受重叠偏倚影响。 该支查出 11 个反向显著蛋白，其中 APOE、NOTCH2、PAM 正是糖尿病对照分析 独立标为「糖尿病驱动」的那批。
两种方法、两条完全不同的推理路径，指向同一批蛋白——可作为正文的交叉验证。
另外 8 个反向显著蛋白：查清后不动摇任何结论
SHBG、AMY2B、TYRO3、NCAN、NCR3LG1、MDGA1、MANSC4、ROBO2
| 核查项 | 结果 |
|---|---|
| 正向显著记录 | 9 条，全部是 T1D/T2D 基础病，并发症 0 条 |
| 进入靶点决策表 | 0 个 |
| 共定位支持 | 0 个（3 个"证据不足"，5 个"不支持"） |
| 出现在糖尿病对照表 | 0 个（该表只比较并发症与糖尿病端） |
它们是与糖尿病本身纠缠的蛋白，从未进入眼科候选清单，结论无需改动。
顺带得到一个阳性对照
SHBG 反向最强（FDR = 2.5e-12）。性激素结合球蛋白与 2 型糖尿病的双向关系 在文献中有充分记载——方法能把它检出来，说明流水线是灵敏的。
七、必须披露的限制
一、T1D 那一支有样本重叠。 GCST90824163 含 UK Biobank（约 44.5% 样本）， 而暴露 UKB-PPP 就是 UKB。反向方向上的重叠会让结果偏向观察性关联。 无法定量拆开其贡献；但 T2D 无重叠也有 39% 显著率，说明功效才是主因，重叠不是唯一原因。
二、并发症的反向工具里混着糖尿病位点。 这是 R9 采用一般人群对照的必然结果。 所以"糖网 → 蛋白"严格讲是"糖尿病 + 糖网易感性 → 蛋白"。 参见 R9 对照定义的取舍。
三、NeovascGlaucoma 只有 3 个工具，该支的任何结论都属证据不足。
八、产物
results/reverse_mr/
├── reverse_instruments.csv 250 条工具记录，237 个唯一位点
├── reverse_mr_results.csv 142 对的完整结果
├── _iv/<疾病>.csv 各疾病的 clump 后工具（带指纹缓存）
└── _prot/<蛋白>.csv 95 个蛋白在工具位点上的效应（带指纹缓存）运行：Rscript analysis/35_reverse_mr.R（可断点续跑；nprot=N 试跑，force 重算）。 全量约 33 分钟，瓶颈在从 D 盘的 tar 流式提取。