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12 · 试剂 · 仪器 · 耗材清单与货源
货源原则：国内可买优先(标 🇨🇳)，括号内附国际金标准对应(标 🌐)。价位为大致参考(2025-2026，人民币)，以实际询价为准。 ⚠️ 大型仪器是实验室固定资产，不用你出钱，但要确认平台有没有(见
10)。
一、核心生物试剂
1. Cas9 蛋白（CRISPR 相关蛋白 9）
- 用途：与 sgRNA 组成 RNP 复合物，是真正切 DNA 的酶。推荐用蛋白而非 mRNA，注射后即时起效、效率高(Gagnon et al., 2014; Burger et al., 2016)。
- 🇨🇳 翊圣 Yeasen Hifi Cas9 Nuclease；诺唯赞 Vazyme Cas9 蛋白；近岸蛋白 Novoprotein。约 ¥1000–2500/管(几十~上百 µg，够打很多次)。
- 🌐 IDT Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3（领域最常用）；NEB EnGen Cas9 NLS；Thermo TrueCut Cas9 Protein v2。
- 关键：选带核定位信号(NLS) 的版本，入核效率高。
2. sgRNA 或 crRNA+tracrRNA（向导 RNA）
两条路线，新手建议路线 A(买合成的)：
路线 A —— 合成 crRNA+tracrRNA（Alt-R 双组分系统，最稳）
- 🌐 IDT Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA(按你的靶序列定制) + Alt-R tracrRNA(通用) + Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer/对照。国内经 IDT 中国或代理(如苏州金唯智 GENEWIZ、生工 Sangon)下单。crRNA 约 ¥300–600/条。
- 优点：质量稳定、无需自己体外转录、可多靶点(每基因设计 3 条提高效率)。
路线 B —— 体外转录(IVT)合成 sgRNA（省钱，需会做无 RNase 操作）
- 用 T7 体外转录试剂盒：🌐 Thermo MEGAshortscript T7 Kit(AM1354)；🇨🇳 翊圣/诺唯赞 T7 高效转录试剂盒。
- DNA 模板：寡核苷酸引物退火或克隆 + T7 启动子；纯化用 🌐 Zymo RNA Clean & Concentrator / 🇨🇳 天根 RNA 纯化柱。
- 参考方案：Jao et al., 2013（多重双等位编辑经典）。
3. 显微注射辅助试剂
| 试剂 | 用途 | 货源 |
|---|---|---|
| 酚红 Phenol red 0.05–0.1% | 注射示踪(看打没打进去) | 🌐 Sigma P0290 / 🇨🇳 生工 |
| 无 RNase 水 / Duplex Buffer | 配 RNP | IDT Nuclease-Free Duplex Buffer；Thermo |
| 矿物油(可选) | 注射针校准 | Sigma M5904 |
| KCl(可选，0.1–0.2 M) | 稀释注射液 | 通用 |
4. 鱼用/胚胎试剂
| 试剂 | 全称/用途 | 货源 |
|---|---|---|
| MS-222 / Tricaine | 间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，麻醉剂，成像/取材前麻醉 | 🌐 Sigma A5040 / E10521；🇨🇳 生工、阿拉丁 |
| PTU | 1-苯基-2-硫脲，抑制黑色素(成像看得清)，0.003%(0.2 mM)从 24 hpf 加 | 🌐 Sigma P7629；🇨🇳 阿拉丁、麦克林 |
| D-葡萄糖 D-glucose | 高糖建模 | 🌐 Sigma G8270；🇨🇳 生工、国药 |
| 甘露醇 D-mannitol | 等摩尔渗透压对照 | 🌐 Sigma M4125；🇨🇳 国药 |
| E3 胚胎培养液 | 养胚胎(自配，配方见 13) | 自配(NaCl/KCl/CaCl₂/MgSO₄) |
| 低熔点琼脂糖 Low-melting agarose | 活体成像包埋(0.8–1.2%) | 🌐 Sigma A9414；🇨🇳 生工 |
| 多聚甲醛 PFA 4% | 固定 | 🇨🇳 生工、碧云天 Beyotime |
5. 基因分型(HRMA/测序)试剂
| 试剂 | 用途 | 货源 |
|---|---|---|
| 基因组提取(碱裂解 HotSHOT 或试剂盒) | 鳍剪/胚胎取 DNA | 50 mM NaOH 自配最省；🇨🇳 天根 DNA 试剂盒 |
| HRM 专用预混(含饱和染料 EvaGreen) | 高分辨率熔解分型 | 🌐 Bio-Rad Precision Melt Supermix；🇨🇳 诺唯赞/翊圣 HRM Mix |
| T7E1 酶(可选替代法) | T7 内切酶 I 错配检测 | 🌐 NEB M0302 |
| 普通 Taq + 测序 | Sanger 测序确认 | 🇨🇳 生工/擎科测序服务 |
6. 表型读出试剂（详见 14）
- 抗体：anti-GFP(增强荧光信号)、视锥标记 zpr-1、视杆外节标记 zpr-3(🌐 ZIRC 斑马鱼抗体库)、isolectin B4(血管)、增殖 PCNA/EdU(🌐 Thermo Click-iT EdU)、凋亡 TUNEL 试剂盒(🇨🇳 碧云天)。
- qPCR：反转录试剂盒 + SYBR 预混(🇨🇳 诺唯赞 HiScript+ChamQ / 翊圣)。
- WB：常规(碧云天/Bio-Rad)。
- 单细胞：10x Genomics Chromium 建库(送 🇨🇳 诺禾致源/华大/联川 测序服务)。
二、仪器设备（实验室固定资产）
显微注射工作站（湿实验线的命脉）
| 仪器 | 举例型号 | 用途 |
|---|---|---|
| 显微注射仪(气动) | 🌐 Eppendorf FemtoJet 4i / WPI PV820 Pneumatic PicoPump | 控制注射压力/时间/注射量 |
| 显微操作臂 | 🌐 Narishige MN-153 + 磁力底座 | 持针定位 |
| 拉针仪 | 🌐 Sutter P-1000 或 P-97 | 把玻璃毛细管拉成注射针 |
| 注射用体视镜 | 🌐 Olympus SZX 系列 / Leica M165 | 注射时观察 |
| 玻璃毛细管 | 🌐 WPI TW100-4 / Sutter BF100-58-10(含丝，1.0 mm) | 做针 |
| 注射模具/琼脂糖槽 | 自制(1–1.5% 琼脂糖 + 梯形模具) | 排卵固定 |
| 载物台测微尺 | 校准注射体积(约 0.5–1 nL/滴) | 定量注射量 |
成像与分析
| 仪器 | 举例 | 用途 |
|---|---|---|
| 激光共聚焦显微镜 | 🌐 Zeiss LSM 880/900 · Leica SP8 · Nikon A1 | 活体血管/荧光三维成像 |
| 光片显微镜(可选) | Zeiss Lightsheet Z.1 | 大体积快速活体成像 |
| 荧光体视镜 | Leica M205 FCA / Olympus | 初筛荧光表型 |
| 切片机 | 冰冻切片机 Leica CM1950 / 石蜡切片机 | 视网膜组织学 |
| 正置荧光/明场显微镜 | 配 IHC/IF 与切片观察 |
分子与功能
| 仪器 | 举例 | 用途 |
|---|---|---|
| 实时荧光定量 PCR 仪 + HRM 模块 | 🌐 Bio-Rad CFX96 / Roche LightCycler 480 | qPCR + HRMA 分型 |
| 普通 PCR 仪、电泳、凝胶成像 | 通用 | 扩增/检测 |
| ERG 记录系统 | 🌐 商品(如 Diagnosys Espion) 或自建(Makhankov et al., 2004) | 视网膜电图 |
| OKR 装置 | 自建(旋转条纹鼓 + 摄像)(Brockerhoff, 2006) | 视动反应 |
| WB 系统、酶标仪 | 通用 | 蛋白 |
三、一次性"起步采购包"（先把敲除跑起来要买的）
新手做第一个基因敲除，最少需要：
- Cas9 蛋白 ×1 管（🇨🇳 翊圣 / 🌐 IDT Alt-R V3）
- crRNA：候选基因 3 条 + 阳性对照
tyr2 条 + tracrRNA 1 管（🌐 IDT） - Nuclease-Free Duplex Buffer、无 RNase 水、酚红
- MS-222、PTU、低熔点琼脂糖、PFA
- 玻璃毛细管 1 盒
- HRM 预混 + 分型引物（送合成，🇨🇳 生工/擎科）
- D-葡萄糖、甘露醇
设备(注射仪/拉针仪/共聚焦/PCR-HRM)默认用实验室或院级共享平台。没有就先解决平台(见
10)。
下一步：按 13 做 sgRNA 设计→RNP 组装→注射→分型。