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11 · 斑马鱼基因功能验证全流程 — 总览与计划
目的：把"从导师组学/遗传学发现的候选基因 → 在斑马鱼里证明它影响糖尿病视网膜病变(DR)表型"做成一套可执行计划。 本文是地图；具体操作见
12(清单货源)、13(CRISPR 操作)、14(建模与读出)、15(参考文献)。 缩写规则：每个英文缩写首次出现给出中英文全称，后文直接用缩写。
0. 名词首次全称表（便于全套文档查阅）
| 缩写 | 英文全称 | 中文 |
|---|---|---|
| DR | Diabetic Retinopathy | 糖尿病视网膜病变 |
| CRISPR | Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats | 成簇规律间隔短回文重复序列 |
| Cas9 | CRISPR-associated protein 9 | CRISPR 相关蛋白 9（核酸内切酶） |
| sgRNA | single guide RNA | 单向导 RNA |
| crRNA | CRISPR RNA | CRISPR RNA（识别靶点的那段） |
| tracrRNA | trans-activating CRISPR RNA | 反式激活 CRISPR RNA（与 crRNA 配对支架） |
| RNP | Ribonucleoprotein (complex) | 核糖核蛋白复合物（Cas9 蛋白+sgRNA） |
| PAM | Protospacer Adjacent Motif | 前间隔序列邻近基序（Cas9 识别的 NGG） |
| indel | insertion/deletion | 插入/缺失突变 |
| F0 / G0 | Founder generation (injected) | 注射代（嵌合体） |
| crispant | CRISPR-injected F0 mosaic mutant | F0 注射代嵌合敲除体 |
| KO | Knockout | 基因敲除 |
| WT | Wild Type | 野生型 |
| dpf / hpf | days / hours post-fertilization | 受精后天数/小时 |
| HRMA | High-Resolution Melting Analysis | 高分辨率熔解曲线分析（分型） |
| PCR | Polymerase Chain Reaction | 聚合酶链式反应 |
| EGFP | Enhanced Green Fluorescent Protein | 增强型绿色荧光蛋白 |
| VEGF | Vascular Endothelial Growth Factor | 血管内皮生长因子 |
| qPCR | quantitative real-time PCR | 实时定量 PCR |
| WB | Western Blot | 蛋白质免疫印迹 |
| IHC / IF | Immunohistochemistry / Immunofluorescence | 免疫组化 / 免疫荧光 |
| ERG | Electroretinography / Electroretinogram | 视网膜电图 |
| OKR | Optokinetic Response | 视动反应 |
| IPL / INL | Inner Plexiform Layer / Inner Nuclear Layer | 内丛状层 / 内核层 |
| scRNA-seq | single-cell RNA sequencing | 单细胞 RNA 测序 |
| PTU | 1-phenyl-2-thiourea | 1-苯基-2-硫脲（抑制色素） |
| MS-222 | Tricaine / ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | 间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（麻醉剂） |
1. 整体逻辑：四阶段闭环
阶段一 候选基因确认 阶段二 制造敲除 阶段三 表型验证 阶段四 机制与成稿
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组学/GWAS候选基因 → sgRNA设计→RNP→显微注射 → 高糖DR建模 + 多维读出 → rescue回复实验
↓ZFIN查斑马鱼直系同源 ↓F0 crispant(几周出数据) ↓血管成像/切片/qPCR/ERG ↓单细胞解析机制
确认基因+设计引物 ↓HRMA验证敲除效率 对比 KO vs WT 表型差异 ↓统计+作图+投稿
↓(可选)建稳定突变系每个阶段对应文档：阶段一/二见 13；阶段三/四见 14。
2. 时间线计划（以你"已会基础建模、需学注射"为前提）
| 时期 | 里程碑 | 关键产出 |
|---|---|---|
| 第 0–2 周 | 平台落实 + 养殖繁育复习 | 确认有鱼房/注射台/共聚焦(见 10 提问清单) |
| 第 3–6 周 | 练显微注射(打酚红/染料) | 注射存活率 >80%、定位准 |
| 第 6–10 周 | 阳性对照跑通 CRISPR：敲 tyr/slc24a5(色素基因，掉色素肉眼可见) | 证明"我的注射+CRISPR 体系有效" |
| 第 10–16 周 | 候选 DR 基因 crispant + 高糖建模 + 血管成像 | 第一批预实验数据(进基金本子) |
| 第 4–7 月 | 补 HRMA 分型、qPCR、切片/IHC 读出 | 表型证据链 |
| 第 6–10 月 | (按需)建稳定突变系 F2 纯合 | 稳定品系，结果更硬 |
| 第 8–12 月 | rescue 回复实验 + ERG/OKR 功能 + (冲高分)单细胞 | 完整"发现-验证-机制"故事 |
快出数据的关键：先用 F0 crispant 路线（Kroll et al., 2021; Wu et al., 2018），不必等建系。多 sgRNA 联合靶向同一基因可让 >90% 注射胚胎成为双等位敲除（Kroll et al., 2021）。
3. 候选基因如何选（阶段一要点）
- 从导师数据来：A1《T2D 并发症蛋白组》(Nat Commun 2025) 的视网膜相关中介蛋白(如 uromodulin、pro-adrenomedullin 等)、或她 GWAS/MR 命中的基因(见
08)。 - 查斑马鱼直系同源基因：在 ZFIN(斑马鱼模式生物数据库, Zebrafish Information Network, zfin.org) + Ensembl 查 ortholog；注意斑马鱼常有 paralog(旁系同源，a/b 两个拷贝)，需判断是否两个都要敲(双敲)。
- 优先级排序：在视网膜/血管有表达(查 ZFIN 表达数据)、有明确通路(VEGF/缺氧/炎症)、人类有疾病关联证据者优先。
- 可成药/可干预者更有转化价值（呼应导师 B4 找靶范式）。
4. 对照设计（决定结果可不可信，务必先想好）
| 对照 | 作用 |
|---|---|
| 未注射 WT + 注射对照 sgRNA(打靶非相关基因/scrambled) | 排除注射本身/脱靶毒性 |
阳性对照基因(tyr 等) | 验证 CRISPR 体系有效 |
| 渗透压对照(高糖建模时用甘露醇 mannitol 等摩尔浓度) | 排除高渗而非高糖效应 |
| rescue 回复(共注射人源/斑马鱼 mRNA 或野生型拷贝) | 证明表型确由该基因缺失引起 |
| 生物学重复 ≥3 窝、每组 n 足够 | 统计效力 |
5. 风险与备选
- 没有斑马鱼平台 → 第一周谈院内合作实验室（见
10）。 - 基因敲除胚胎致死(早期必需基因) → 用条件性/组织特异手段，或只分析存活到表型期的、或用吗啉代(morpholino)瞬时敲低做交叉验证(注意需与突变体互证)。
- F0 表型不稳定(嵌合性) → 提高敲除效率(多 sgRNA)、增大 n、必要时建稳定系确认。
- 候选基因有 paralog 冗余 → 双敲(同时打 a 和 b 拷贝)。
下一步：按 12 备齐试剂仪器 → 按 13 做敲除 → 按 14 建模读出。所有引用见 15。