10 · 斑马鱼上手路线 · CRISPR 入门 · 复杂度与成本评估

你的起点：会斑马鱼基础建模（如葡萄糖浸泡、表型观察），没做过基因敲除/转基因。 结论先行：你缺的核心只有一项手上功夫——显微注射；其余都是可快速学会的流程活。 利好：斑马鱼 F0 crispant（注射代嵌合敲除）就能看表型，上手后几周内能出预实验数据。 最大不确定性不是技术、不是钱，而是 刘俊老师组里有没有斑马鱼平台（她是干实验/组学 PI）。

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一、操作复杂度：分三层

层级	内容	难度	说明
① 分子/设计	sgRNA 设计、买 Cas9 蛋白、买/合成 sgRNA	★☆☆ 易	免费工具 CHOPCHOP/CRISPRscan；RNP（Cas9 蛋白+合成 sgRNA）现成可买，不必自己体外转录
② 显微注射	单细胞期把 RNP 打进受精卵	★★★ 唯一真门槛	练 2–6 周可上手，熟练靠量；这是你要重点攻的技能
③ 筛选/分型	PCR + HRMA / T7E1 / 测序判断敲除效率	★★☆ 中	标准分子生物学，可学

关键利好：不一定要建稳定系

• 多条 sgRNA 联合注射时，很多基因在 F0 注射代就有表型（crispant）。
• 含义：打针→养几天→在高糖模型里看 DR 表型，几周内出数据，不必等 2–3 代建纯合系。
• 稳定突变系（F2 纯合，约 3–6 个月）留到冲高分论文时再补。

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二、上手路线（按你的背景定制）

阶段	做什么	目标
前 2 周	确认养鱼/繁育流程、配对取卵时机、胚胎处理	复用已有基础，快速进入
第 1 月	专练显微注射：先注射酚红/染料到单细胞期胚胎	存活率高、定位准、手稳
第 1–2 月	拿有可见表型的阳性对照基因练 CRISPR：色素基因 tyr / slc24a5（敲掉→肉眼掉色素）	验证"我的注射+CRISPR 确实有效"——全球新手标准做法
第 2–3 月	换成从导师组学数据挑的 DR 候选基因，做 crispant + 葡萄糖高糖建模，看血管新生/神经退行表型	出预实验数据，进基金本子
后续	建稳定突变系、单细胞/空间转录组解析机制、rescue 实验	冲高分论文

学习方式：① 找院内/合作实验室有经验的人手把手带注射（最快）；② 看《The Zebrafish Book》+ Nature Protocols / Bio-protocol 的 CRISPR 注射 protocol；③ 先在斑马鱼 community 经典阳性对照上跑通全流程再上自己课题。

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三、成本评估：单次实验很低，钱在"平台"

单次实验耗材（低）

• 斑马鱼一窝产几百枚卵、胚胎免费；亲鱼可反复繁育。
• Cas9 蛋白：一管可打很多次，分摊到每次极低。
• 合成 sgRNA：每条约几十到一百多元（IVT 自制更便宜）。
• 玻璃针、培养皿、E3 培养液等：常规低值耗材。
• → 做一个基因敲除实验的试剂成本，量级很低，远低于哺乳动物实验。

设备/平台（贵，但是实验室出，不是你出）

设备	用途	谁出
显微注射仪 + 显微操作臂 + 拉针仪 + 体视镜	注射	实验室固定资产
循环水养鱼系统（鱼房）	养殖繁育	实验室/院级平台
共聚焦 / 光片显微镜	活体血管/神经成像	多为院级共享平台，按机时收费
ERG、PCR/测序仪	功能/分型	实验室或共享

⚠️ 核心风险：刘俊老师是干实验/组学方向，组里大概率没有现成斑马鱼平台。

• 有平台 → 你单次实验成本低、推进快。
• 没平台 → 需找院内/校内合作斑马鱼实验室借平台，或从零搭建（设备投入大、周期长，需导师立项支持）。 这件事必须进组第一周问清，它决定你的湿实验线能不能跑起来。

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四、进组第一周关于平台的提问清单

1. 组里/院里有没有斑马鱼养殖系统？我能用还是要找合作实验室？
2. 有没有显微注射整套设备？谁能带我练注射？
3. 共聚焦/光片显微镜、ERG 在哪、怎么预约、机时费谁出？
4. 做 CRISPR 的试剂经费走谁的项目？预算大概多少？
5. 如果没有现成平台，导师是否支持与院内斑马鱼课题组合作（共享平台、合作署名）？
6. 有没有现成的转基因品系（如 Tg(fli1:EGFP) 血管系）可用，还是要自己引种/构建？

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五、一句话总结

• 技术上：你能做。唯一要专门练的是显微注射（2–6 周入门），CRISPR 设计与分型都是流程活，F0 crispant 让你快速出数据。
• 钱上：单次实验便宜，贵的是设备——而设备是实验室的事，不用你掏。
• 真正要落实的：平台有没有。有，就照第二节路线走；没有，第一周就和导师谈合作实验室方案。