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13 · CRISPR 基因敲除实验操作 SOP
配
11(计划)、12(清单)使用。参数标注：标【文献】= 来自所引论文；标【常用值】= 领域代表性经验值，需按你实验室校准。 引用见15。本流程默认走 RNP 注射 + F0 crispant 路线(最快出数据)。
步骤 1 · sgRNA 设计（阶段一→二的桥）
- 在 ZFIN(zfin.org) + Ensembl 确认候选基因的斑马鱼直系同源基因、外显子结构、是否有 paralog(a/b 拷贝)。
- 用在线工具设计 sgRNA：
- CHOPCHOP(chopchop.cbu.uib.no)——选基因组、列出靶点并打分(Labun et al., 2019, Nucleic Acids Res)。
- CRISPRscan(crisprscan.org)——斑马鱼活性预测模型(Moreno-Mateos et al., 2015, Nat Methods)。
- 选靶规则：
- 靶在早期共有外显子(确保所有转录本被破坏)，最好编码关键功能域上游。
- 紧邻 PAM(前间隔序列邻近基序，NGG)。
- GC 含量 ~40–60%，CRISPRscan 高分，避开脱靶位点(工具会给脱靶预测)。
- 每个基因设计 3 条 sgRNA 联合注射——可把 >90% 注射胚胎变成双等位敲除(Kroll et al., 2021)，大幅提高 F0 表型可靠性。
- 同时设计 HRMA/测序分型引物：扩增子 80–200 bp、靶点居中(见步骤 6)。
- 阳性对照基因也设计 sgRNA：
tyr(酪氨酸酶，敲除→黑色素消失) 或slc24a5(敲除→色素减少)，肉眼可判(Kroll et al., 2021)。
步骤 2 · RNP 复合物组装（注射当天，冰上无 RNase 操作）
以 IDT Alt-R 双组分系统(crRNA+tracrRNA)为例。【常用值】，请按试剂说明微调。
- crRNA 与 tracrRNA 退火成 gRNA 双链：等摩尔混合(各 ~50–100 µM)，95 ℃ 5 min → 缓慢降至室温。
- 组装 RNP：将退火 gRNA 与 Cas9 蛋白按摩尔比约 1:1 混合(终浓度常用 Cas9 ~5–10 µM、每条 gRNA 相当量；多条 gRNA 时各取等份)。
- 室温孵育 5–10 min 形成 RNP(部分方案 37 ℃ 5–10 min；RNP 注射常用室温/37℃短孵育，参考 Burger et al., 2016 思路)。
- 加 酚红至终浓度 ~0.05% 作示踪。
- 体积换算参考：注射工作液中 Cas9 蛋白常用 ~0.5–1 µg/µL、每条 sgRNA 数十–数百 pg/胚胎 当量；新手先用厂家推荐起始浓度再做梯度优化。
- 全程冰上，配好尽快用。
替代(IVT sgRNA + Cas9 蛋白)：sgRNA 工作液常见 ~30–100 pg/nL、Cas9 蛋白 ~300–600 pg/nL 当量(Jao et al., 2013; Gagnon et al., 2014 体系)，按窝优化。
步骤 3 · 准备胚胎与注射针
- 前一天傍晚配对亲鱼(雌雄分隔)，次日早晨开灯后撤隔板自然产卵；收集单细胞期受精卵(0–~45 min，关键时间窗)。
- 拉注射针：Sutter P-1000，玻璃毛细管(含丝)拉成细长针；显微镜下用镊子/磨针仪开口成斜面。
- 校准注射量：注射到矿物油中的载物台测微尺，调注射压力/时间使每滴 ~0.5–1 nL【常用值】。
- 把受精卵排进琼脂糖注射槽，单细胞朝上。
步骤 4 · 显微注射（核心手上功夫）
- 注射仪参数起点【文献/常用值】：注射压力 ~550 hPa、注射时间 ~0.1 s、补偿压 ~10 hPa(可参考厂家与 CRISPR-Cas9 RNP 注射方案的报道值)，按针口实际滴量调。
- 打入位置：单细胞期注入卵黄靠近细胞处或直接打入细胞(blastomere)；越靠近细胞越好(嵌合性更低)。
- 每胚注 1 滴(~1 nL)；含酚红可见红色滴确认成功。
- 注射后把胚胎转入 E3 培养液，28.5 ℃ 培养(标准温度)。
- 新手训练法：先只打酚红/染料，练到存活率 >80%、注射准、速度快，再上 RNP。
- 先做阳性对照：打
tyrsgRNA RNP，2–3 dpf 看黑色素是否消失——消失即证明你的注射+CRISPR 体系有效(Kroll et al., 2021)。
步骤 5 · F0 crispant 培养与初筛
- 注射后 1 dpf 去除死胚/未受精卵；记录存活率与畸形率(评估毒性)。
- 24 hpf 起若需成像，加 PTU 0.003% 抑制色素。
- 抽样验证敲除效率：取少量注射胚胎(如 8–10 枚)做 HRMA/测序(步骤 6)，确认编辑成功且效率高，再用同窝其余做表型。
- F0 是嵌合体：表型可能不完全、个体差异大 → 加大 n、设好对照、多 sgRNA 提高效率(Kroll et al., 2021; Wu et al., 2018)。
- 进入表型读出(见
14)：可在幼鱼期(crispant) 直接做高糖建模 + 血管成像，几周内出数据。
步骤 6 · 基因分型（确认敲除：HRMA 为主）
HRMA(高分辨率熔解曲线分析)：快、便宜、灵敏，能检出 G0 低至 ~5% 的嵌合(Samarut et al., 2016; Parant et al., 2009)。
- 取材提 DNA：单胚/成鱼鳍剪，用 HotSHOT 碱裂解法(50 mM NaOH 95 ℃ ~20 min，再加 Tris 中和)或商品试剂盒。
- HRM-PCR：用步骤 1 设计的引物(扩增子 80–200 bp、靶点居中) + 含饱和染料的 HRM 预混(如 Bio-Rad Precision Melt Supermix)，在带 HRM 模块的 qPCR 仪上扩增。
- 熔解分析：升温采集熔解曲线；突变样本(含 indel)的熔解曲线偏离 WT → 判定有编辑/区分基因型。
- 确证：对代表样本做 Sanger 测序(可用 ICE/TIDE 在线工具解析 indel 谱)或 T7E1 错配酶切(NEB M0302)辅证。
- 全流程从鳍剪到出结果约数小时内(Samarut et al., 2016)。
步骤 7 · （可选）建立稳定突变系
当 F0 表型需要更硬的证据、或要做精细机制时。耗时但可靠(F2 纯合约 ≥6 个月，Kroll et al., 2021)。
- F0 × WT 交配 → F1(杂合，含可遗传 indel)。
- F1 长成后鳍剪 HRMA/测序筛出携带移码/明确功能缺失等位的个体，记录确切突变。
- F1 × F1(同突变)→ F2，分型筛 纯合突变体(KO) 与同窝 WT 同胞作对照。
- 用 F2 及后代做正式表型/机制实验，结果最可信。
关键质控清单
- [ ] sgRNA 3 条/基因、CRISPRscan 高分、脱靶低
- [ ] 阳性对照(
tyr)掉色素 = 体系有效 - [ ] 注射存活率 >80%、畸形率可接受
- [ ] HRMA 确认编辑效率高(>50% 理想)
- [ ] 对照齐全(WT、scrambled sgRNA、渗透压、rescue)
- [ ] 生物学重复 ≥3 窝
下一步：表型读出与机制 → 14。