14 · 糖尿病视网膜病变(DR)建模与表型读出 SOP

在 13 得到 KO/crispant 后，本文教你造 DR 模型 + 四类读出(血管成像 / 组织学+免疫染色 / qPCR+WB / ERG+OKR+单细胞)对比 KO vs WT。 参数标注同 13：【文献】/【常用值】。引用见 15。

---

A. 高血糖(DR)建模

斑马鱼 DR 模型有两条主线，新手先用葡萄糖浸泡(幼鱼)最快：

A1. 葡萄糖浸泡 — 幼鱼快速模型（首选，几天出血管表型）

• 原理/证据：3 dpf 起浸泡高糖，几天内出现视网膜/玻璃体血管改变、VEGF 上调(Jung 等"斑马鱼 DR 筛选模型" Biomed Pharmacother 2021; 综述 Wiggenhauser & Hammes 2021)。
• 操作：
  1. 3 dpf 幼鱼置 葡萄糖溶液中浸泡；常用浓度区间 ~50–130 mM【文献，按目的选】(报道中 130 mM 组血管直径明显增大；≥160 mM 出现形态改变可能过强)。
  2. 关键对照：等摩尔 甘露醇组(排除高渗效应) + 正常 E3 组。
  3. 交替浸泡降低毒性：高糖↔养液交替(部分方案每天换)，记录存活。
  4. 5–6 dpf 起读表型(血管成像/qPCR)。
• 成体长期模型：成鱼交替浸泡葡萄糖约 30 天可致 IPL/INL 变薄(Gleeson et al., 2007)——做神经退行/慢性表型时用。

A2. 遗传模型 pdx1⁻/⁻（稳定、贴近"真糖尿病"）

• 原理：CRISPR 敲除胰腺转录因子 pdx1 → 胰腺发育异常、持续高血糖 → 视网膜血管新生激活(Wiggenhauser et al., 2020, Diabetes)。
• 用途：需要稳定糖尿病背景时；可与你的候选基因 KO 杂交做上位分析。

选择建议：预实验/筛表型用 A1 幼鱼葡萄糖浸泡(快、便宜)；机制/慢性用 A2 或成体 A1。

---

B. 读出一 · 血管成像（必做，斑马鱼最大优势）

B1. 活体荧光血管成像

• 品系：Tg(fli1:EGFP)——fli1 启动子驱动 EGFP 标记全部血管内皮(Lawson & Weinstein, 2002, Dev Biol)。把你的候选基因 KO/crispant 做在该荧光背景上(注射到该品系胚胎，或杂交)。
• 操作：
  1. 加 PTU 抑色素；成像前 MS-222 麻醉。
  2. 低熔点琼脂糖 0.8–1.2% 包埋幼鱼，侧卧固定于玻底皿。
  3. 激光共聚焦(Zeiss LSM/Leica SP8) z-stack 扫眼部，三维重建玻璃体/视网膜血管。
• 量化指标(用 ImageJ/Fiji)：血管直径、血管密度、分支点数、玻璃体血管(hyaloid)形态、无灌注区、新生血管出芽。高糖下典型为血管直径增大、VEGF 上调(幼鱼模型)。

B2. 成体视网膜血管铺片（更精细的血管定量）

• 成鱼取眼 → 显微解剖分离视网膜 → tg(fli:EGFP) 荧光下铺片成像与定量(JoVE 56674: "Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish")。

---

C. 读出二 · 组织学 + 免疫染色

1. 固定：4% PFA 4 ℃ 过夜。
2. 切片：石蜡或冰冻切片(冰冻需蔗糖梯度脱水 + OCT 包埋)，取眼球过视神经的矢状/横切面。
3. 常规组织学：HE 染色 → 测视网膜分层厚度(IPL/INL/外核层等)、感光细胞层。高糖慢性模型可见 IPL/INL 变薄(Gleeson et al., 2007)。
4. 免疫荧光(IF)/免疫组化(IHC)：

   标记	抗体	看什么
   血管内皮	anti-GFP(增强) / isolectin B4	血管
   视锥	zpr-1(ZIRC)	视锥细胞
   视杆外节	zpr-3(ZIRC)	视杆/外节退行
   增殖	PCNA / EdU(Click-iT)	Müller 细胞再生反应
   凋亡	TUNEL 试剂盒	神经元死亡
   胶质	GFAP / 谷氨酰胺合成酶	Müller 细胞活化

5. 共聚焦/荧光显微镜成像，ImageJ 定量阳性细胞数/荧光强度/层厚。

---

D. 读出三 · 分子（qPCR + Western blot）

D1. qPCR（mRNA 表达）

1. 取材(整胚或解剖眼组织，n≥3 窝，每样数十胚池样)→ TRIzol 提总 RNA。
2. 反转录(🇨🇳 诺唯赞 HiScript) → SYBR qPCR(ChamQ)。
3. 目标基因：你的候选基因(确认敲低)、VEGF(vegfaa)、缺氧 hif1、炎症(il1b、tnfa、il6)、血管标志(kdrl、cdh5)、内参(actb1、rpl13a、ef1a)。
4. 2^−ΔΔCt 法相对定量，KO vs WT 对比。

D2. Western blot（蛋白）

• 验证候选基因蛋白下降及通路蛋白(如 VEGF、HIF-1α、磷酸化通路)；眼/全胚裂解，标准 SDS-PAGE → 转膜 → 抗体孵育 → 化学发光。

---

E. 读出四 · 视觉功能 + 单细胞（进阶/冲高分）

E1. OKR 视动反应（无创、快速筛功能）

• 原理：旋转条纹诱发眼动反射，4 dpf 起可测，每尾约 1 min(Brockerhoff, 2006, Nat Protoc)。
• 操作：6% 甲基纤维素固定幼鱼于皿中，外周旋转条纹鼓 + 摄像记录眼动；可测视敏度/对比敏感度。

E2. ERG 视网膜电图（视网膜功能金标准）

• 原理：光刺激下记录视网膜总和电位，反映外层视网膜功能。可用自建或商品装置对完整幼鱼无创记录(Makhankov et al., 2004, J Neurosci Methods；幼鱼 ERG 见 JoVE 52662)。
• 操作要点：暗适应 → 麻醉/固定 → 微电极置角膜 → 给闪光 → 记录 a 波/b 波振幅与潜伏期，KO vs WT 比。

E3. 单细胞/空间转录组（机制 + 高分）

• 解离 KO vs WT 视网膜(高糖 vs 正常)→ 10x Genomics 建库 → 测序(🇨🇳 诺禾致源/华大)→ Seurat 分析细胞亚群、状态转变(尤其 Müller 细胞、内皮、神经元)、差异通路。这块正好用你干实验线(07)的生信技能。

---

F. 统计与作图

• 正态/方差齐性检验 → 两组用 t 检验、多组用单因素 ANOVA + 事后检验；非正态用非参数检验。
• 生物学重复 ≥3，报告精确 n、均值±SD/SEM、确切 P 值。
• 作图：GraphPad Prism；图像排版 Illustrator/Inkscape；机制示意图 BioRender。
• 报告规范参考动物实验 ARRIVE 指南。

---

G. 一个完整验证实验的最小组合（建议先做这套出预实验）

1. 候选基因 crispant 做在 Tg(fli1:EGFP) 上 + tyr 阳性对照 + scrambled 对照 (13)
2. 3 dpf 起葡萄糖浸泡(含甘露醇渗透对照) (A1)
3. 5–6 dpf 共聚焦血管成像 + ImageJ 定量 (B1)
4. qPCR 测候选基因↓ 与 vegfaa/炎症因子变化 (D1)
5. HRMA 确认敲除效率 (13 步骤 6)
6. n≥3 窝，Prism 统计作图 (F)

→ 这套数据足够写进基金本子和第一篇论文的预实验部分。后续按需加切片/IHC、ERG、单细胞、稳定系、rescue。

引用全部见 15-参考文献.md。