主题
靶点功能验证 · 干分析进展（dr-amd-targets 项目）
承接 实验验证方案：干分析当漏斗、新意押功能验证。本页记录独立项目
dr-amd-targets（与 mr-pipeline 完全分开）的干分析进展。 ⚠️ 准确性：GEO 差异表达为实测结果；参考文献均检索核实（摘要级）；生物学解读含推断，已标注。
项目位置：/home/research/dr-amd-targets/（WSL，research 用户）。只从 mr-pipeline 复制候选 shortlist 作输入，不改 mr-pipeline。
一、DrugReflector 已核实（真实 · 可装）
课程宣传的"2025 Science 首发筛药算法"基本属实：
- Python 包 github.com/Cellarity/drugreflector（
import drugreflector as dr），权重在 Zenodo。 - Science 原文 Active learning framework leveraging transcriptomics… (adi8577)。
- 原理：基于 Connectivity Map（9597 扰动×52 细胞系）的集成神经网络，按基因签名排化合物。可用于"疾病/靶点签名 → 候选化合物"。
二、GEO 差异表达（实测结果）
数据集（均已本地下载解析）：
候选基因差异表达（病组 vs 参照）：
| 靶点 | DR（PDR vs 视网膜） | AMD（RPE-脉络膜） |
|---|---|---|
| MERTK | ↓ logFC −0.62, FDR 0.018 | 无变化 |
| SPRY2 | ↓ FDR 0.013 | ns（p 0.13） |
| TNFRSF10A | ↑ FDR 0.008 | ns（p 0.023 名义） |
| TNXB | ↑ FDR 0.015 | ns（p 0.043 名义） |
| CFH | ↑ FDR 0.003 | ns |
| AGER(RAGE) | ↑ p 0.022（FDR 0.056） | ns |
| CFI / NFKB1 / CSF2 | 名义 ↑ | ns |
解读：
- DR 里 MERTK↓、SPRY2↓ 与 TNFRSF10A↑、AGER↑、CFH↑ 显著——你的候选在 DR 转录层面确有改变。MERTK↓ 与"高糖损害 MerTK"原文（PMC8835591）方向一致，可信度加分。
- AMD 候选在 bulk mRNA 基本无显著——遗传/蛋白信号不一定反映在转录本（可能在蛋白层面、或在特定细胞类型被 bulk 稀释）。
⚠️ 两个必须如实写的 caveat：
- DR 那套是 FVM（病理新生血管膜）vs 正常视网膜，差异部分来自组织类型不同，不纯是疾病效应——需在结论里披露。
- AMD bulk mRNA 阴性是真实局限，不是候选不重要，而是 bulk 转录本读不出——正是需要单细胞（分细胞类型）+ 蛋白/功能实验来补的地方。
三、单细胞数据集调研（待导师圈定）
见 results/scrna_survey/datasets.md。初步：AMD/RPE 定位用含 RPE 的人视网膜图谱（GSE142449 待核实覆盖）；DR 用 GSE165784（PDR FVM）+ GSE230348（健康视网膜）。关键：AMD-MERTK 定位需数据含 RPE；DR 需含血管内皮/Müller。
四、WGCNA 共表达模块（实测）
AMD（GSE29801，样本足）：power=4，16 个模块。
- MERTK 与 SPRY2 落在同一个共表达模块（blue） —— 在 RPE-脉络膜里共表达，提示可能同通路/共调控。
- AGER/TNFRSF10A/APOE 不在 top-5000 高变基因内，未分配。
- 模块-疾病相关较弱（|r|≤0.2，最强 p≈0.009）——与"AMD 候选 bulk mRNA 信号弱"一致。
DR（GSE60436）：仅 9 样本，WGCNA 功效不足，跳过（如实标注，不硬跑）。
五、单基因 GSEA（实测，fgsea + GO-BP）
clusterProfiler 依赖链（enrichplot）在本环境装不动，改用 fgsea + org.Hs.eg.db 自建 GO-BP 基因集，等价且更轻。每靶点：全基因按与靶点表达相关性排序 → fgsea。
- AMD-MERTK：正富集氧化磷酸化 / 细胞呼吸 / 电子传递链（RPE 代谢活跃，MERTK 与线粒体代谢共表达）。
- DR-MERTK / SPRY2：正富集视觉感知 / 光感受器信号（与光感受器轴一致），负富集"化学刺激检测"。
- DR-AGER：与线粒体呼吸/ATP 合成负相关。
已扩充基因集库（04_gsea_msigdb.R，msigdbr 7.5.1 自带数据 + fgsea）：Hallmark + KEGG + Reactome 均已跑。DR 里 MERTK/SPRY2 富集氧化磷酸化/TCA/呼吸链 + 视觉光转导；AGER 与呼吸链负相关。结果 results/gsea/*_{Hallmark,KEGG,Reactome}.csv。
⚠️ 强 caveat：DR 的这些通路（氧化磷酸化 / TCA / 光转导 / 嗅觉转导）高度反映 FVM vs 视网膜的组织成分差异（视网膜=高代谢神经元/光感受器，FVM=纤维血管），不是纯靶点通路——DR 的 GSEA 解读要非常谨慎。AMD（MERTK）那套组织一致（均 RPE-脉络膜），更可信。
关于 clusterProfiler：其可视化层（treeio→ggtree→enrichplot）在本环境（R4.3.3 + Bioc 3.18 + 可得 CRAN 版本）有顽固的 yulab 生态版本错配（treeio 缺
random_ref、ggtree 缺check_linewidth），需精确多包版本 pin，不值得。GSEA 计算已由 fgsea 完成（clusterProfiler 内部也是调 fgsea），结果等价且可发表；出版级 GSEA 图可用 fgsea::plotEnrichment + ggplot2 手搓。
出版级 GSEA 图（fgsea::plotEnrichment + ggplot2，600dpi）
汇总 dotplot（Hallmark，每靶点 top6；x=数据集·靶点，色=NES 红正蓝负，大小=−log10FDR）：
跑分图示例（DR·MERTK — 氧化磷酸化，NES=5.41）：
图很直观地暴露了那条 caveat：DR 的 MERTK/SPRY2 富集全被氧化磷酸化/代谢主导，而这些正是 FVM vs 视网膜的组织成分差异信号——图好看，但 DR 的 GSEA 结论要谨慎，别当成纯靶点通路。全部图见
results/gsea/figures/（6 张跑分图 + 汇总 dotplot，均 PNG 600dpi + 矢量 PDF）。
至此 B 的三块（DEG + WGCNA + GSEA[GO+Hallmark+KEGG+Reactome]+出版级图）全部完成。
待办
- 待导师定：单细胞数据集、主靶点（DR 里 MERTK/SPRY2 已有转录证据）、斑马鱼通量。
- 下一步：导师圈定单细胞数据集后跑细胞类型定位 + CellChat + Monocle；选定靶点后 scTenifoldKnk 虚拟敲除 + DrugReflector 筛药。
六、单细胞细胞类型定位（DR，实测）
数据 GSE165784（PDR/PVR 纤维血管膜 scRNA，6 样本，人源）。标准流程：per-sample 加载 → QC → harmony 整合 → 分群 → 典型 marker 注释（module-score argmax，不依赖外部参考集）→ 靶点定位。10074 细胞 / 14 群。
细胞组成（FVM 以小胶质为主，与原文一致）：
| 细胞类型 | 细胞数 | 占比 |
|---|---|---|
| 小胶质/髓系 | 8580 | 85% |
| 壁细胞/成纤维 | 783 | 8% |
| T/NK | 296 | 3% |
| 内皮 | 269 | 3% |
| Müller 胶质 | 92 | 1% |
| 光感受器 | 54 | 0.5% |
⭐ MERTK 定位（核心）——平均表达 / 阳性细胞比例（病组 vs 各细胞类型）：
| 靶点 | 主要表达细胞 | 证据 |
|---|---|---|
| MERTK | 小胶质/髓系（avg 0.71，25% 阳性）；内皮/壁细胞仅 ~8% | 落在 FVM 主导群 |
| CFH | 内皮(85%)+壁细胞(67%) | 血管/基质 |
| SPRY2 | 壁细胞/成纤维(10%) | 与"SPRY2→血管/间质"设想一致 |
| AGER(RAGE) | 光感受器(7%，整体低) | FVM 里信号弱 |
为什么有价值：MERTK 在 DR 现在有三层证据链——遗传(MR 提名) → bulk 转录(↓ FDR0.018) → 单细胞定位到主导的小胶质/髓系群，把"高糖损害 MerTK 吞噬"接到了人 DR 组织的具体细胞类型（指向小胶质吞噬通路）。
⚠️ caveat：① FVM 本身 85% 是小胶质，MERTK 定位有"分母偏倚"成分，但 25%(小胶质) vs 8%(内皮) 的阳性率差异支持它确为髓系偏好；② 注释为 module-score argmax（较粗），精细亚群需 marker 复核。脚本 analysis/11_dr_scrna.R，结果 results/scrna_dr/。
DR 细胞通讯 CellChat（实测，GAS6/PROS1–MERTK 轴）
在同一 DR FVM 数据上跑 CellChat（1474 个高变配体-受体对，69 条显著通路）。聚焦 TAM 受体（MERTK/AXL/TYRO3）轴，检出的显著 L-R：
| 来源 → 靶 | 配体 → 受体 | pval |
|---|---|---|
| 光感受器 → 小胶质/髓系 | GAS6 → MERTK | 0 |
| 内皮 → 小胶质/髓系 | PROS1 → MERTK | 0 |
| 光感受器 → 壁细胞 | GAS6 → AXL | 0 |
| 内皮 → 壁细胞 | PROS1 → AXL | 0 |
小胶质/髓系是 GAS6/PROS1→MERTK 信号的接收方——正对应 MERTK 的**胞葬/吞噬（efferocytosis）**功能：微胶质通过 MERTK 接收来自光感受器(GAS6)与内皮(PROS1)的"清除"信号。至此 MERTK 在 DR 有四层证据：遗传(MR) → bulk↓ → 单细胞定位小胶质 → 细胞通讯(TAM 轴，微胶质为受体)。
⚠️ caveat：GAS6 在通路级聚合并非主导通路（top 通路是 MK/PTN/SPP1/APP 等），TAM 轴信号强度偏弱——结论落在"L-R 对显著检出"层面，不宣称 GAS6 是 DR 主通路。脚本 analysis/21_dr_cellchat.R，结果 results/cellchat_dr/。
DR 小胶质活化轨迹（Slingshot 假时序，实测）
工具说明：原计划用 Monocle3，但其 1.4.x 硬依赖 BPCells，而 BPCells 需系统库 libhdf5（本环境 research 用户无 sudo 装不了），且 monocle3 无 1.3.x 的 git tag 可 pin。改用 Slingshot（Street 2018，Saelens 2019 Nat Biotech benchmark 排名最高的轨迹方法之一，纯 R 无系统库依赖，高分文章通用）。这是被迫的等价替换，非偷懒。
在 DR 小胶质/髓系子集（8580 细胞）上重算 PCA/UMAP + 子分群（10 亚群），以静息态（P2RY12/CX3CR1 最高的 cluster）为轨迹起点。基因 vs 假时序 Spearman ρ：
| 随活化下降 ↓ | ρ | 随活化上升 ↑ | ρ |
|---|---|---|---|
| CX3CR1（静息） | −0.40 | SPP1 | +0.40 |
| MERTK | −0.31 | LGALS3 | +0.36 |
| GAS6 | −0.28 | GPNMB | +0.28 |
| P2RY12（静息） | −0.16 | TREM2 | +0.13 |
解读：轨迹捕捉到 homeostatic（P2RY12/CX3CR1↓）→ 活化/DAM 样（SPP1/LGALS3/GPNMB↑） 转变。MERTK 连同 TAM 轴（GAS6/AXL）随活化下降——提示活化的 DR 微胶质丢失 MERTK 介导的胞葬能力。给 MERTK 再加一层：高在静息态小胶质、活化后掉。⚠️ caveat：CD68 亦随假时序下降（−0.42），DAM 范式里个别标志物方向可变，轨迹方向以 P2RY12-high 起点锚定；假时序为计算推断非真实时间。脚本 analysis/25_dr_slingshot.R，结果 results/slingshot_dr/。
AMD 单细胞（GSE230348，实测，RPE/脉络膜）
数据 GSE230348 人视网膜 + RPE/脉络膜，Normal / Early-Inter / Intermediate / Atrophic AMD 疾病梯度。聚焦 RPE/脉络膜样本（mRPE+tRPE，35 样本 QC 后 50723 细胞），per-sample 细胞上限 2500 防内存爆。细胞图谱 RPE 20084(40%) + T/NK + 成纤维 + 免疫髓系 + 光感 + 内皮等 8 类。
MERTK 定位：免疫/髓系 avg 1.08（最高）> RPE 0.30 > 内皮 0.28——RPE 与巨噬都做 MERTK 依赖的吞噬（RPE 吞噬光感受器外节），生物学合理。
⭐ 一个必须如实记录的严谨性教训——校验挡住了假阳性：
| 检验方法 | MERTK RPE：AMD vs 正常 | 结论 |
|---|---|---|
| 细胞级 Wilcoxon（反保守） | log2FC −0.67, adj p 0.0096 | 貌似"AMD 下调" |
| per-sample 伪bulk（n=21 vs 13，正确，2026-07-27 补全分组后） | log2FC +0.71, Wilcoxon p=0.076 | 未达显著；方向为 AMD 侧偏高 |
细胞级"下调"是伪重复（pseudoreplication）假阳性（Squair et al. 2021, Nat Commun），per-donor 伪bulk 一测即消失。如实结论：MERTK 在 AMD 有细胞定位（RPE+髓系），但无 AMD vs 正常转录差异——与之前 AMD bulk mRNA 阴性一致，AMD 的 MERTK 证据在遗传/蛋白层面而非转录。不可写"AMD 里 MERTK 转录下调"。脚本 analysis/12_amd_scrna_rpe.R + 13_amd_pseudobulk.R，结果 results/scrna_amd/。
下一步（待 token）：用此 RPE/脉络膜图谱构建眼组织专属签名矩阵 → CIBERSORTx 反卷积 DR/AMD bulk（用户已选注册版路线，避免 LM22 血液签名套眼组织）。
七、视网膜 eQTL 数据获取（EGA Live Outbox）+ 共定位
获批 EGAD50000002082 = Manchester Eye Tissue Repository（METR-GT）：201 正常供体 NSR + RPE 的 WGS + bulk-RNA + 视网膜 eQTL（tensorQTL），共 1856 文件 / 15.9 TB。
⭐ 这套数据正好补 MR 流水线 stage 10 视网膜 eQTL 共定位的洞（当时缺数据），并给出 MERTK 等在 RPE vs NSR 的表达。
只需下 0.95 GB（跳过 15.9 TB 原始）：
| 类型 | 数量 | 大小 | 用途 |
|---|---|---|---|
| tsv | 4 | 311 MB | eQTL 汇总统计（NSR/RPE cis-eQTL） |
| gct | 359 | 640 MB | 每样本表达矩阵（MERTK RPE vs NSR） |
| — | 15.9 TB | 原始，全跳过 |
关键坑与正确流程
- EGAD5 开头的数据集 pyega3 用不了（会 403 / 卡在数据服务器）→ 必须走 Live Outbox = SFTP + Crypt4GH（新 Federated EGA，文件在 CRG 非 EBI）。
- 文件清单可从公开元数据 API 无认证拿（pyega3 的 files/datasets 会卡）：
curl https://metadata.ega-archive.org/datasets/EGAD50000002082/files（给 accession_id + extension + filesize，但无文件名）。 - Live Outbox 步骤：
- 生成 ssh-ed25519 密钥（outbox 接受 ssh-ed25519 或 c4gh-v1；ssh 一把管 SFTP 登录 + crypt4gh 解密最省事）
- 公钥加到 EGA 网页 Edit Profile → Public Keys → Add a new key（官方：同步到 outbox 需几小时）
sftp -i 私钥 -o "User=你的EGA邮箱" outbox.ega-archive.org（端口 22）ls看真实文件名 →get 文件.c4ghcrypt4gh decrypt --sk 私钥 < 文件.c4gh > 明文（注意输入输出别同名）
- 公钥同步：加公钥后约 90 分钟（官方说"几小时"）SFTP 才连上；连上后 outbox 里
EGAD50000002082可访问，真实文件名 = 每供体MANGT_{id}.{NSR|RPE}.rnaseqc.gene_reads.gct.c4gh等。 - ★下载必走代理（实测提速 ~24×）：WSL 侧直连 CRG（西班牙）仅 ~100 KB/s；改 Windows 侧
sftp+ncatSOCKS5 代理（同服务器连接配置的 ProxyCommand）达 ~2.35 MB/s，234 MB 的 NSR eQTL 从 ~40 分钟缩到 40 秒。解密crypt4gh decrypt --sk ega_ssh_ed25519（ssh-ed25519 私钥直接当 c4gh 密钥）已验证。
视网膜/RPE eQTL 共定位（实测，结果偏冷但如实）
拿到 NSR（神经视网膜）+ RPE 的 cis-eQTL（tensorQTL，NSR 9959 eGene / RPE 3699 eGene）后，与 FinnGen R13 疾病 GWAS 做 coloc.abf（真实 N/s：DR=RetinopathyStrict 6970/88076；AMD=H7_AMD 13947/458803）：
| 靶点 | 组织 eQTL × 疾病 | 结果 |
|---|---|---|
| TNXB | 视网膜 × DR | PP.H4 = 0.68（提示性，167 SNP） |
| MERTK | 视网膜 × DR | PP.H4 = 0.01（强视网膜 eGene p1.7e-8，但 DR 在该位点无 GWAS 信号，PP.H1=0.99） |
| SPRY2 / AGER / TNFRSF10A | 视网膜 × DR | 非视网膜 eGene，无法检验 |
| MERTK/APOE/TNFRSF10A/TGFB1/CASP10/CFH | RPE × AMD | 全部非 RPE eGene，无法检验 |
诚实解读：
- TNXB 是唯一有组织级遗传支持的（视网膜 eQTL/DR 共定位 PP.H4=0.68）——但它在 MHC 区（chr6p21），LD 复杂，MHC 共定位需谨慎，且无斑马鱼同源。
- MERTK 在视网膜是强 eGene 但不与 DR 共定位——组织 eQTL 层不给 MERTK-DR 加遗传分。MERTK 的 DR 证据仍是 MR + 表达 + 细胞定位 + 活化轨迹，不含视网膜-eQTL-共定位（如实划清，不夸大）。
- 多数靶点因眼 eQTL 功效低（N~176-183）不是 eGene，测不了——数据集真实局限。
⚠️ caveat：该 eQTL 是研究发布的**显著 cis-eQTL 对（aFC）**而非全 nominal，coloc 用共享 SNP；要测更多靶点需下 gct 全表达矩阵自算 eQTL 或用其他视网膜 eQTL 源（EyeGEx 等）。脚本 analysis/30_eqtl_coloc.R，结果 results/coloc_eqtl/。
方向 B：bulk 表达矩阵——靶点组织定位（NSR vs RPE，实测）
同一 EGA 数据集下的 359 个 RNA-SeQC 表达矩阵（gct） 全下载 + 解密后（183 神经视网膜 NSR + 176 RPE），做 limma-voom RPE vs NSR 差异表达——不需要基因型，回答"候选靶点主要在哪个眼组织表达"。全组差异极显著（21144 / 25514 基因 FDR<0.05）。
| 靶点 | NSR logCPM | RPE logCPM | logFC (RPE/NSR) | adj.P | 定位解读 |
|---|---|---|---|---|---|
| CFH | 3.67 | 6.13 | +2.45 | 4e-52 | RPE/脉络膜高——补体沉积部位，吻合 AMD 生物学 |
| TGFB1 | 2.54 | 4.74 | +2.17 | 6e-61 | RPE 高 |
| TNXB | 2.90 | 3.72 | +0.83 | 6e-13 | RPE 略高 |
| CASP10 | 0.45 | 1.16 | +0.70 | 3e-15 | 两组都低 |
| MERTK | 4.15 | 4.83 | +0.63 | 1e-18 | NSR / RPE 两组织都表达、RPE 略高——吻合"RPE 吞噬光感受器外节 + 视网膜小胶质清除"双重定位 |
| AXL | 4.88 | 5.02 | +0.15 | ns | 两组织均表达 |
| TNFRSF10A / TYRO3 | — | — | ns | — | 无组织差异 |
| GAS6 | 5.78 | 5.22 | −0.54 | 9e-16 | NSR 略高 |
| AGER | 2.78 | 1.98 | −0.74 | 3e-21 | NSR 高 |
| APOE | 9.66 | 8.77 | −0.90 | 3e-26 | NSR 高（整体表达最高的靶点） |
解读：这是组织 compartment 对比（NSR vs RPE），不是疾病对比——回答"靶点在哪个眼组织表达"，为细胞系选择提供依据（例：MERTK 双组织表达 → ARPE-19 与视网膜小胶质模型都合理）。CFH 在 RPE 高表达与其 AMD 中的补体机制自洽；MERTK 双组织定位与前面单细胞（小胶质 + RPE/髓系）一致。脚本 analysis/31_gct_nsr_vs_rpe.R，结果 results/gct_expr/（DE 表 + 候选组织定量表 + box/volcano 图 600dpi）。
八、可复现（含网络坑）
bash
# 全部走 research 用户
sudo -u research Rscript analysis/00_install_pkgs.R # 装包(Westlake Bioc镜像)
sudo -u research Rscript analysis/01_bulk_analysis.R # GEO差异表达
sudo -u research Rscript analysis/02_wgcna_gsea.R # WGCNA+单基因GSEA网络坑（都踩过）：
- bioconductor.org 国内被墙（WSL 直连 000）→ 装 Bioc 包改用 Westlake 镜像
mirrors.westlake.edu.cn/bioconductor/packages/3.18/{bioc,data/annotation}（WSL 直连 200，不用代理）。 - Windows 的 SOCKS5 代理
127.0.0.1:10808WSL 侧不可达，只有 Windows 侧curl.exe --proxy socks5h://127.0.0.1:10808能用 → GEO/国外数据从 Windows 侧下载。 - GEO series matrix + GPL annot 手动解析（不依赖 GEOquery，规避其在线下载）。
九、下游功能验证待办（分子对接 / 虚拟敲除 / 筛药）
这几项尚未开跑，都**卡在"先锁定主打靶点"**这一步——不是遗漏，是有意暂缓。与其并行的多组学 MR刚好就是用来定靶点的，结论已出。
| 项 | 状态 | 卡在哪 / 前置 | 备注 |
|---|---|---|---|
| 分子对接 | 未跑 | 需锁靶点 + 定蛋白结构 + 化合物 | 对接流水线已装好（含 PyMOL，异步竞态 bug 已修）；对接不需要遗传因果，只要可成药蛋白 + 结构 |
| scTenifoldKnk 虚拟敲除 | 未跑 | 需锁靶点（单细胞矩阵 DR 已有） | 在靶点所在细胞类型上做 in-silico 敲除，看下游网络扰动 |
| DrugReflector 筛药 | 未跑 | 用户要求放最后 | 环境已核实真实可装（见本页第一节） |
靶点决策（多组学 MR 已给出依据）
- MERTK：遗传/多组学五数据类型全弱，但生物学 + 转化最强（RPE 吞噬定位、可成药、基因治疗已进临床）。→ 适合做功能/转化主线：分子对接（MERTK 激酶域有现成 PDB + 已知抑制剂）+ 虚拟敲除。对接不依赖遗传因果，MERTK 完全成立。
- CASP10 / TNFRSF10A：遗传稳健（3 层多组学 + 共定位 + IAMDGC 复制），可作共同主打做对比对接。
执行顺序（锁靶点后）：分子对接 → scTenifoldKnk 虚拟敲除 → DrugReflector 筛药（最后）。属
dr-amd-targets项目，与多组学 MR 分开、互不影响。