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实验验证方案 · DR/AMD 细胞与斑马鱼模型 + 候选靶点对应
承接 文献核查 与 分家重跑结果：干 MR 已被抢，新意押在功能验证。本页给出可验证的细胞/在体模型与候选靶点对应。
⚠️ 准确性边界：下列参考文献均已在 PubMed/PMC 检索核实存在（以标题+链接为准），但为摘要/检索级信息，非逐篇全文精读——正式写方案前请自行过原文。候选→细胞的对应是按蛋白功能/通路的推断，非某篇原文直接指定。
一个关键策略点：细胞模型绕开"斑马鱼同源"这道坎
斑马鱼 KO 需要同源基因，DR 的 MHC 命中、CSF2、补体基因全无斑马鱼同源，做不了。 但人视网膜细胞系直接操作人的基因（siRNA / CRISPR / 过表达），没有同源限制——斑马鱼做不了的 DR 靶点，在细胞里能验。这把 DR 可验证的池子大幅放大。
DR / 视网膜常用细胞模型（已核实出处）
| 细胞 | 建模 | 主要读出 | 参考（摘要级） |
|---|---|---|---|
| 人视网膜微血管内皮 HRMEC/hREC | 高糖 25–50 mM + 甘露醇渗透对照 | 增殖、迁移、成管(血管新生)、通透性/屏障、凋亡、VEGFA | VEGF/PlGF 高糖 HREC (PMC6814860) · 内皮+神经退行模型 (PubMed 34805414) · miR-16-5p 靶 VEGFA/TGFBR1 (PMC11957861) · Cx43 新生血管 (PMC9478119) |
| Müller 胶质 MIO-M1（人系） | 高糖 / 糖波动 | 胶质化(GFAP/Vimentin)、炎症(NF-κB/COX-2)、VEGF 分泌、RAGE | 高糖胶质化 (PMC11641291) · 醛糖还原酶炎症 (PMC12295778) · RAGE 调控 Müller 炎症 (Diabetologia 2010) |
| 视网膜周细胞 | 高糖 + 缺氧 | 周细胞丢失(DR 早期标志)、内皮功能障碍 | 周细胞高糖→内皮障碍 (PMC13283316) |
| RPE（ARPE-19） | 高糖（DR 外屏障）/ 也用于 AMD | 光感受器外节(POS)吞噬、屏障、凋亡、补体 | 高糖损害 MerTK (PMC8835591) · RPE 吞噬筛选平台 (PMC7724476) · MERTK 三敲吞噬定量 (Front Mol Neurosci 2023) · Mertk 触发 POS 摄取 (PubMed 11861639) |
| 视网膜神经元(RGC/光感受器) | 高糖 | 神经退行 | ⚠️ 勿用 RGC-5（已证实为错误鉴定细胞系）；用原代 RGC 或 R28 |
斑马鱼 DR 在体模型（若做在体，已核实）
- 高糖诱导玻璃体-视网膜血管改变 · 短期 DR 模型 (PubMed 26276677)
- pdx1−/− 遗传糖尿病突变体 · 视网膜血管扩张 (Diabetes 2020)
- 130 mM 高糖 DR 筛选模型 · 可重复性验证 (Sci Rep/EurJPharm)
- 甲基乙二醛诱导视网膜新生血管 · 新生血管性视网膜病变模型 (PMC6501125)
- 斑马鱼神经血管单元分析 (PMC8228394)
候选靶点 → 建议验证细胞（推断，非原文直接给）
完整表见流水线
results/shortlist/screenable_with_cells.csv（含全部候选 + 细胞 + 读出 + 斑马鱼可用性）。以下为 A/B 级头部。
⚠️ 2026-07-26 已用 NCBI Gene + Ensembl 同源实查订正下表的"斑马鱼"列， 详见本页新增的 同源性实查结果。原表有 3 处与实查数据冲突，已改。
| 靶点 | 病/证据 | 建议细胞 | 验证读出 | 斑马鱼 |
|---|---|---|---|---|
| MERTK | AMD/复制 | ARPE-19 | POS 吞噬 + 高糖(MerTK 活化) | mertka ✅（但见下方"新颖性警告"） |
| APOE | AMD/共定位+复制(A) | ARPE-19 | 脂质处理/drusen | apoea/b ✅ |
| CASP10 ⭐ | AMD/A | ARPE-19 | 高糖凋亡(caspase/Annexin V) | casp10 ✅ 1:1（且小鼠无此基因） |
| TNFRSF10A | AMD/A | ARPE-19 | RPE 凋亡(TRAIL/PKCα) | ❌ 小鼠、斑马鱼均无可用同源 |
| SPRY2 | AMD/A | HRMEC | 成管/迁移(FGF-血管新生) | spry2 ✅ |
| TGFB1 | AMD/A | HRMEC | 屏障通透/纤维化(TGFBR1) | tgfb1a/b ✅ |
| AGER(RAGE) | DR/复制 | MIO-M1 Müller | 高糖炎症(NF-κB/COX-2) | ❌ 斑马鱼无 RAGE→只能细胞 |
| NFKB1 | AMD/复制 | MIO-M1 Müller | 炎症转录(NF-κB) | nfkb1 ✅ |
| CSF2 / TNFSF14 | AMD/复制 | Müller/小胶质 | 促炎因子分泌 | CSF2 无同源→只能细胞 |
| 补体 CFB/CFI/CFP | AMD/复制 | ARPE-19 | 补体激活(C3b/MAC) | 多无同源→只能细胞 |
| TNXB | DR/复制 | HRMEC | 细胞外基质/屏障 | tnxba ✅ |
同源性实查结果（2026-07-26）
数据源：NCBI Gene（esearch 符号检索 + esummary）与 Ensembl Compara 同源。 立项前建议再用 ZFIN 复核一次符号检索为阴性的条目（命名差异可能造成假阴性）。
| 靶点 | 小鼠 | 斑马鱼 | 结论 |
|---|---|---|---|
| CASP10 | 无此基因（NCBI 零命中） | casp10 GeneID 557302, chr9，one2one，同一性 30.8% | ⭐ 只有斑马鱼能做 |
| TNFRSF10A | 无（仅 Tnfrsf10b） | 无符号匹配；Ensembl 仅 many2many，同一性 13.8–15.1% | ❌ 两种模式动物都做不了 |
| AGER | Ager ✅ | 零命中（无 RAGE） | ❌ 斑马鱼做不了 |
| CSF2 | Csf2 ✅ | 零命中 | ❌ 斑马鱼做不了（且已被 Pu 2024 报道） |
| MERTK | Mertk ✅ | mertka ✅ | ✅ 可做 |
| CFH | Cfh ✅ | cfh ✅ | ✅ 可做 |
| SPRY2 | Spry2 ✅ | spry2 ✅ | ✅ 可做 |
| TGFB1 | Tgfb1 ✅ | tgfb1a / tgfb1b ✅ | ✅ 可做（双旁系，需同时敲） |
三条由此产生的硬约束
- TNFRSF10A 功能验证全线受阻——动物模型无同源，且它在视网膜/RPE 中 logCPM ≈ −1.2（基本不表达，见 10 · 组织定位）。只能走"循环蛋白"叙事，不能走组织功能验证。
- AGER 是 DR 侧唯一稳健命中，但斑马鱼无 RAGE——DR 的 AGE-RAGE 主线只能在 MIO-M1 Müller 细胞做。
- CASP10 的"小鼠无此基因"是资产不是负担——过去二十年小鼠研究全部绕开了 CASP10，斑马鱼是唯一在体模型。这一点可直接写进 Significance。
⚠ CASP10 的前置条件
斑马鱼 casp10 与人 CASP10 虽为 1:1 直系同源，但同一性仅 30.8%，功能保守性不能假设。 必须先做 人源 CASP10 mRNA 回补（rescue）实验：若人 mRNA 能救回斑马鱼突变体表型，才说明该模型可外推。 这既是必需的对照，本身也是可发表的数据点；若 rescue 失败，整条线需要重新设计。
⚠ MERTK 的新颖性警告
原文档把 MERTK 列为"最值得押"。从可行性看它确实最顺，但从新颖性看它是最差的选择之一：
- Mertk 突变的 RCS 大鼠是视网膜变性领域最经典的模型之一，MERTK 与 RPE 吞噬光感受器外节的关系是教科书内容；MERTK 突变致人视网膜色素变性（RP38）也早已确立。"敲掉 mertk → 光感受器/RPE 出问题"是完全可预期的结果。
- 更关键的是：本课题的因果遗传层不支持 MERTK——coloc H4 = 0.01、deCODE 平台复制阴性、视网膜 eQTL 全 null（见 多组学 MR · 干分析）。
- AMD 侧 bulk 转录也是阴性（GSE29801 中 MERTK adj.P = 0.873）。
→ 建议：MERTK 降级为功能佐证，主线换 CASP10（唯一可行在体模型 + 可裁决一个公开的方法学分歧，见下）。
⭐ 为什么 CASP10 值得作主线
- 物种独占：小鼠无此基因，斑马鱼是唯一在体模型。
- 裁决一个公开分歧：Pu 2024 (PMC11187347) 的补充表里 CASP10 × AMD 的 SMR b = −0.2485（与本课题的 −0.25 几乎逐位吻合），但他们因 HEIDI 拒绝（p=0.035）判为 LD 假象而未报道；本课题 coloc 给 H4 = 0.97（强共定位）。同一位点、两种方法、相反结论，目前无人能裁——用实验去裁，叙事强度高于"验证已知靶点"。
- 组织表达支持：CASP10 在 RPE 显著高于神经视网膜（+0.70, p=2.6e−15），可用 ARPE-19。
- 与 TNFRSF10A 同属 TRAIL 通路（DR4 → caspase-8/10）：斑马鱼做 CASP10、人源细胞做 TNFRSF10A，可拼成一条完整的"TRAIL-凋亡轴在 AMD"故事。
（原文）MERTK 为什么曾被认为最值得押
一个 ARPE-19 体系把 AMD 和 DR 都覆盖：
- AMD 侧：MERTK 是 RPE 吞噬光感受器外节的核心受体，突变致视网膜色素变性 RP38（PubMed 11861639）；吞噬定量/敲低方法成熟（Front 2023）。
- DR 侧：已有原文"高糖损害 ARPE-19 中 MerTK 表达与活化"（PMC8835591）——直接把你的 AMD 遗传信号接到糖尿病语境。
- 斑马鱼：mertka 是干净 1:1 同源，可在体确认。
完整验证链条
MR 提名（宽池，本课题已有）
↓ 视网膜单细胞：定位到细胞类型（RPE? 内皮? Müller?）
↓ 对应人细胞系高糖模型：siRNA/CRISPR 敲低 或 过表达 → 功能读出
↓（选做）斑马鱼在体：有同源者 KO + DR 表型（pdx1−/− 或高糖模型）
★ 功能证据 = 原创，抢不走 ★要点：细胞在前（快、多、无同源限制），斑马鱼在后（在体、需同源）。DR 靠 Müller/内皮细胞找回被 MHC/无同源卡掉的靶点。
注：ARPE-19 为常用但去分化的自发转化 RPE 系；HRMEC 有供体差异；MIO-M1 为永生化 Müller 系——细胞系各有局限，关键结论建议原代细胞或在体复核。参考文献为检索核实、摘要级，未逐篇精读。