08 · 单细胞定位与伪 bulk

⚠ 代码目录与 01–07 不同。01–07 讲 /home/research/multiomics-mr/（多组学 MR）； 08–10 讲 /home/research/dr-amd-targets/analysis/（功能验证），是独立项目目录。
本页回答组会最常被问的一句："你单细胞到底怎么做的、凭什么说 MERTK 定位在小胶质？" 所有参数以实际脚本为准，不是通用教程值。

对应脚本：11_dr_scrna.R（DR）、12_amd_scrna_rpe.R（AMD）、13_amd_pseudobulk.R（严格确认）

数据与样本

	DR	AMD
GEO	GSE165784 纤维血管膜（PDR/PVR）	GSE230348 RPE/脉络膜
样本	6 例（4 例 dense tsv + 2 例 10X tar）	mRPE/tRPE 多例，读 `amd_manifest.csv` 定分组
分组	`PDR`（含 F47） vs `PVR_RRD`	`AMD` vs `Normal`（由 `disease` 字段 grepl "AMD"）
额外	—	`region` = Macula / Peripheral（由样本名首字母 m/t 判）

QC 门槛（两套数据不同，别记混）

# DR (11_dr_scrna.R)
nFeature_RNA >= 200 & nFeature_RNA <= 6000 & percent.mt < 20

# AMD (12_amd_scrna_rpe.R)
nFeature_RNA >= 200 & nFeature_RNA <= 7000 & percent.mt < 25

建对象时两边都是 min.cells = 3, min.features = 200。

AMD 侧有个必须主动交代的处理：CAP <- 2500，每样本随机下采样到 2500 个细胞（内存限制）。另外 QC 后 样本细胞数 < 50 的样本整个丢弃。下采样对"定位在哪种细胞"稳健，但任何涉及绝对细胞数/比例的结论都要标注。

整合与聚类（两边一致）

NormalizeData → FindVariableFeatures(nfeatures = 2000) → ScaleData
→ RunPCA(npcs = 30) → RunHarmony(group.by.vars = "sample")
→ RunUMAP(reduction = "harmony", dims = 1:30)
→ FindNeighbors(dims = 1:30) → FindClusters(resolution = 0.5)

set.seed(1)。批次变量是 sample（不是 disease，避免把疾病效应整合掉）。

★ 细胞注释：不是手工点的，是模块评分 argmax

这是最容易被追问的一点。没有人工指认细胞类型，用的是标准 marker panel 打模块分、再按 cluster 均分取最大值自动指派：

markers <- list(
  Microglia_Myeloid = c("PTPRC","AIF1","CX3CR1","P2RY12","CSF1R","C1QA","C1QB","ITGAM","CD68","LYZ"),
  Endothelial       = c("PECAM1","VWF","CLDN5","CDH5","FLT1"),
  Mural_Fibroblast  = c("PDGFRB","ACTA2","RGS5","COL1A1","DCN","LUM"),
  T_NK              = c("CD3D","CD3E","NKG7","GNLY"),
  RPE               = c("RPE65","BEST1","RLBP1","TYR"),
  Photoreceptor     = c("RCVRN","RHO","PDE6A"),
  Muller_Glia       = c("GLUL","VIM","SLC1A3","SOX9"))

for (lin in names(markers)) merged <- AddModuleScore(merged, features = list(g), name = paste0("sc_", lin), seed = 1)
cl_mean <- aggregate(...[, sc_cols], by = list(cl = merged$seurat_clusters), FUN = mean)
merged$celltype <- cl2lin[...]     # 每个 cluster 取模块分均值最大的那一系

优点：可复现、无主观。 局限（要如实讲）：argmax 是强制指派——每个 cluster 必被分到某一系，没有 "Unknown" 出口。若某 cluster 是双胞体或未覆盖的细胞类型，会被硬塞进最近的一系。正式发表建议补一张 cluster × 模块分热图作为注释可信度证据。

靶点定位的两个读出

avg <- AverageExpression(merged, features = targets, group.by = "celltype", assays = "RNA")$RNA
pct <- tapply(FetchData(merged, vars = g)[,1] > 0, merged$celltype, function(x) 100*mean(x))

即 平均表达 + 阳性率，两者一起看。PPT 里"MERTK 平均表达 0.71、阳性率 25% vs 其他细胞类型 7%"就出自这里（target_avgexpr_by_celltype.csv / target_pctexpr_by_celltype.csv）。

★ 2026-07-26 独立复算查出两处表述错误（数值本身无误）

tools/verify_singlecell.R 脱离流水线重算后发现：

0.71 不是"模块评分"，是平均表达。AddModuleScore 在本脚本里只用于细胞类型 marker panel 的自动注释，从未用于 MERTK。原表述会让人以为 MERTK 有一个模块分。
对照组标签写错：原写"阳性率 25% vs 整体 8%"。实测全细胞池阳性率是 22.4%，而 7.0% 才是「非小胶质/髓系细胞」的阳性率。所以正确表述是 25% vs 其他细胞类型 7%。

⚠️ 口径提醒：AverageExpression 对 log 归一化数据是先 expm1 再求均值（0.7126）；若直接对 log 值求均值会得到 0.3063，两者不是同一个量，复核时容易误判为"算错了"。

查的靶点：MERTK, SPRY2, AGER, TNFRSF10A, CFH, TGFB1（取与矩阵行名的交集，缺的自动跳过）。

★ 伪 bulk：为什么不用细胞级 Wilcoxon

13_amd_pseudobulk.R 开头的注释就写明了理由：

avoiding the anticonservative cell-level Wilcoxon (Squair et al. 2021 Nat Commun)

细胞级检验把同一个体的上万个细胞当独立样本，p 值被严重高估。所以 AMD vs Normal 的差异走每样本伪 bulk：

cnt <- GetAssayData(rpe, assay = "RNA", layer = "counts")   # 原始 counts,不是 normalized
pb  <- sapply(levels(factor(samp)), function(s) Matrix::rowSums(cnt[, samp == s]))
mertk_cpm <- 1e6 * pb["MERTK", ] / colSums(pb)              # CPM
df <- df[df$n_cells >= 20, ]                                # 每样本至少 20 个 RPE 细胞
w <- wilcox.test(a, n); t <- t.test(log1p(a), log1p(n))     # 两种检验都报

判定：样本级 Wilcoxon + Welch t（log1p）两个都报，不挑好看的。 PPT 结果图 7 的"AMD vs 正常无差异"就是这里出来的——这是阴性结果，如实保留。 ⚠ 2026-07-27 更新：样本分组补全后（22→34 份），Wilcoxon p=0.076、log2FC +0.71，仍未达显著，但方向为 AMD 侧偏高（与功能丧失假说相反）。旧的 p=0.82 是在 22 份、且 40.4% 细胞被误判为「分组未知」的情况下算出的，已作废。

这一层能证明什么、不能证明什么

能	不能
靶点表达在哪种细胞	❌ 不能证明因果
疾病 vs 正常在该细胞里有无表达差异（伪 bulk）	❌ 不能替代共定位——MERTK 在这里定位清晰，但 coloc H4=0.01
为选细胞系提供依据（定位到 RPE → 选 ARPE-19）	❌ 样本量小（DR 6 例、AMD 下采样），效应量不可外推

★ 写作红线：单细胞定位是功能层证据，与因果遗传层（MR+共定位）分开陈述，不可混为"多层收敛因此因果"。

输出物

results/scrna_dr/     dr_fvm_seurat.rds, celltype_by_sample.csv,
                      target_avgexpr_by_celltype.csv, target_pctexpr_by_celltype.csv
                      figures/ umap_celltype.png, umap_sample.png, dotplot_targets.png, feature_*.png
results/scrna_amd/    amd_rpe_seurat.rds, MERTK_RPE_pseudobulk_by_sample.csv
                      figures/ MERTK_RPE_pseudobulk_box.png

全部图 dpi = 600、英文标签，符合结果图统一作图规范。

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08 · 单细胞定位与伪 bulk ​

数据与样本 ​

QC 门槛（两套数据不同，别记混） ​

整合与聚类（两边一致） ​

★ 细胞注释：不是手工点的，是模块评分 argmax ​

靶点定位的两个读出 ​

★ 伪 bulk：为什么不用细胞级 Wilcoxon ​

这一层能证明什么、不能证明什么 ​

输出物 ​