09 · 细胞通讯与活化轨迹

代码目录同 08：/home/research/dr-amd-targets/analysis/。本页讲 MERTK 证据链里最靠后的两层——GAS6/PROS1→MERTK 胞葬轴与小胶质活化轨迹是怎么算出来的。 ⚠ 其中活化轨迹这一层已于 2026-07-27 撤下（见本页末），MERTK 由「六层收敛」改为「五层收敛」。

对应脚本：21_dr_cellchat.R（通讯）、25_dr_slingshot.R（轨迹）、23_dr_monocle.R（未执行，见下方红框）

★ 必须先说的一处订正

23_dr_monocle.R 脚本存在但从未成功运行：

WSL 中 monocle3 未安装（requireNamespace("monocle3") 返回 FALSE）
results/monocle_dr/ 目录不存在，无任何输出
原因见 25_dr_slingshot.R 头部注释："Substitutes monocle3 (blocked: BPCells needs libhdf5, no sudo)"

因此"monocle3 第二方法交叉验证、方向一致"这一说法目前没有结果支撑，汇报与论文中都不能这样写。轨迹分析当前只有 Slingshot 一种方法。若要第二方法交叉验证，需先解决 libhdf5 依赖再实跑。

一、细胞通讯 CellChat（`21_dr_cellchat.R`）

输入是 08 存下的 dr_fvm_seurat.rds，分组变量为 celltype。

cc <- createCellChat(object = GetAssayData(seu, assay="RNA", layer="data"),
                     meta = data.frame(labels = seu$celltype), group.by = "labels")
cc@DB <- CellChatDB.human          # 人类完整配受体库,未按 subset 裁剪
cc <- subsetData(cc)
cc <- identifyOverExpressedGenes(cc)
cc <- identifyOverExpressedInteractions(cc)
cc <- computeCommunProb(cc, type = "triMean")   # ★ triMean = 保守设定
cc <- filterCommunication(cc, min.cells = 10)   # ★ 少于10个细胞的类型不参与
cc <- computeCommunProbPathway(cc)
cc <- aggregateNet(cc)
cc <- netAnalysis_computeCentrality(cc)

两个关键参数要能答出来：

参数	值	含义
`type = "triMean"`	三均值	CellChat 默认，偏保守——只有在较大比例细胞中表达才算数，比 `"truncatedMean"` 更不容易出假阳性
`min.cells = 10`	10	细胞数少于 10 的细胞类型被剔出通讯网络

TAM 轴的实际结果（`TAM_MERTK_axis_communication.csv`）

按 MERTK|GAS6|PROS1|AXL|TYRO3 匹配配体/受体/互作名筛出：

source → target	配体 → 受体	prob	通路
Photoreceptor → Microglia_Myeloid	GAS6 → MERTK	8.99e−4	GAS
Endothelial → Microglia_Myeloid	PROS1 → MERTK	6.47e−4	PROS
Photoreceptor → Mural_Fibroblast	GAS6 → AXL	1.57e−3	GAS
Endothelial → Mural_Fibroblast	PROS1 → AXL	1.13e−3	PROS

读法：小胶质/髓系确实处在 GAS6/PROS1 的接收端，配体来自光感受器与内皮——与胞葬（efferocytosis）的生物学一致。 但要注意：同样的配体对 AXL（同属 TAM 家族）的 prob 更高（1.57e−3 vs 8.99e−4）。写作时不能只挑 MERTK 那两行讲，AXL 的信号更强这件事必须一并呈现，否则是选择性报告。

二、活化轨迹 Slingshot（`25_dr_slingshot.R`）

为什么是 Slingshot

脚本注释写明：monocle3 被依赖问题挡住，改用 Slingshot，理由是 Saelens 2019 轨迹方法基准测评中排名靠前。这是一个合理的替代选择，但替代 ≠ 交叉验证。

流程与根锚定（最常被追问的一步）

mg <- subset(seu, subset = celltype == "Microglia_Myeloid")   # 只取小胶质/髓系
mg <- FindVariableFeatures(nfeatures=2000) → ScaleData → RunPCA(npcs=20)
   → RunUMAP(dims=1:20) → FindNeighbors(dims=1:20) → FindClusters(resolution = 0.4)

homeo <- c("P2RY12","CX3CR1","TMEM119","SELPLG")     # 稳态小胶质 marker
mg <- AddModuleScore(mg, features = list(homeo), name = "homeo", seed = 1)
start_clus <- names(which.max(tapply(mg$homeo1, mg$seurat_clusters, mean)))   # ★ 根 = 稳态分最高的亚簇

sce <- slingshot(sce, clusterLabels = mg$seurat_clusters,
                 reducedDim = "PCA",          # ★ 在 PCA 上算轨迹,不是 UMAP
                 start.clus = start_clus)

要点：

亚聚类 resolution = 0.4（比 08 的全局 0.5 低，亚状态更粗）
根不是随便指的，是"稳态四基因模块分最高的亚簇"——这是可复现的客观规则
轨迹在 PCA 空间学习（UMAP 只用于画图），这是 Slingshot 的推荐做法

沿伪时序的实际相关（Spearman，`gene_pseudotime_correlation.csv`）

CD68     -0.418      TREM2    +0.130
CX3CR1   -0.398      FTL      +0.186
MERTK    -0.307      GPNMB    +0.276
GAS6     -0.282      LGALS3   +0.364
APOE     -0.277      SPP1     +0.395
AXL      -0.228
P2RY12   -0.161
TMEM119  -0.149

轨迹方向自校验通过：稳态标记（P2RY12/CX3CR1/TMEM119）为负、活化标记（SPP1/LGALS3/GPNMB）为正，说明伪时序确实是"稳态→活化"方向，不是反的。

~~MERTK ρ = −0.307~~ ⚠ 该数值已作废（2026-07-27）：它同时受两个人为因素影响 —— ① 混入 1 例非糖尿病 PVR/RRD 样本（贡献 32.6% 小胶质细胞）；② 脚本硬编码只取第 1 条支线。按 PDR 分层重跑后 Slingshot 给出 6 条支线，逐支线方向自校验后，方向可解释的 3 条中 MERTK ρ = −0.04 / +0.12 / +0.17，均不为负 → 该证据层已撤下。详见修复前后对比 §5.1。

⚠ 一个必须自己先想清楚的弱点

MERTK 的 ρ（−0.307）与稳态标记 CX3CR1（−0.398）处在同一量级。这意味着 MERTK 的下降可能只是"随稳态程序整体下调"，而非独立的生物学事件。要把它讲成"活化态特异性丢失 MERTK"，需要补一步：控制稳态模块分之后 MERTK 与伪时序是否仍相关（偏相关或加协变量的回归）。当前代码没有做这一步。

三、这两层的证据分量

	能支持	不能支持
CellChat	小胶质处于 GAS6/PROS1 接收端，通路存在	❌ 不能证明该通路在疾病中被改变（没做 AMD/DR vs 正常的差异通讯）
Slingshot	MERTK 沿活化轴下降	❌ 单方法、无交叉验证；❌ 未排除与稳态程序共变

★ 两者都是描述性的。加上 08 的定位、10 的 bulk 差异，构成"MERTK 功能故事"，但因果遗传层始终不支持 MERTK（coloc H4=0.01、deCODE 与视网膜 eQTL 全阴）。详见多组学 MR · 干分析。

输出物

results/cellchat_dr/   dr_cellchat.rds, significant_pathways.txt,
                       LR_communication_all.csv, TAM_MERTK_axis_communication.csv
                       figures/ aggregate_interactions.png, pathway_*.png, signaling_role_heatmap.png
results/slingshot_dr/  dr_microglia_slingshot_sce.rds,
                       gene_pseudotime_correlation.csv, track_genes_along_pseudotime.csv
                       figures/ umap_pseudotime.png, umap_MERTK.png, MERTK_vs_pseudotime.png, trend_*.png
results/monocle_dr/    ❌ 不存在（未执行）

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09 · 细胞通讯与活化轨迹 ​

一、细胞通讯 CellChat（21_dr_cellchat.R） ​

TAM 轴的实际结果（TAM_MERTK_axis_communication.csv） ​

二、活化轨迹 Slingshot（25_dr_slingshot.R） ​

为什么是 Slingshot ​

流程与根锚定（最常被追问的一步） ​

沿伪时序的实际相关（Spearman，gene_pseudotime_correlation.csv） ​

三、这两层的证据分量 ​

输出物 ​